Ⅰ.siRNA抑制CSB基因表达及对细胞增殖和辐射敏感性的影响 Ⅱ.α粒子诱发癌变细胞中p14和p16基因甲基化及表达变

发布时间：2020-10-10 17:46

　　 目的：研究RNAi(RNA interference)对CSB表达的抑制作用，构建CSB表达抑制的细胞模型及探讨CSB的生物学功能。 方法：根据CSB基因序列及其二级结构特征，依据Tuschl等设计siRNA的原则，确定并合成了针对CSB基因的siRNA，构建2个siRNA质粒；利用脂质体方法将siRNA质粒转染HeLa细胞株，以转染阴性质粒的细胞为对照；细胞经潮霉素筛选后以半定量RT-PCR法及Western blot检测siRNA的抑制效应；通过绘制生长曲线，研究CSB对于细胞增殖方面的影响；不同UV剂量照射后，通过集落克隆形成率，流式细胞术，荧光染色法，研究CSB对于细胞凋亡方面的影响。 结果：2组siRNA均可有效抑制CSB基因的表达，其RT-PCR结果表明其在转录水平的抑制分别为44.47％与53.52％，Western blot结果说明其蛋白表达亦受到明显的抑制；细胞增殖动力学检测结果首次表明，2组CSB-siRNA均可降低HeLa细胞的增殖速度；其在5J／m~2 UV照射后细胞存活率分别为29.1±4.5％和44.8±5.7％，显著低于CN-siRNA对照组60.8±5.0％，P＜0.001，其在10J/m~2 UV照射后细胞存活率分别为12.0±2.6％和11.5±3.0％，同样显著低于CN-siRNA对照组20.6±5.3％，P＜0.001；流式细胞术结果表明，转染两组siRNA的HeLa细胞与与阴性对照相比表现出较高的自发凋亡率，10J／m~2 UV照射后，转染两组siRNA的HeLa细胞的凋亡率与阴性对照相比较均表现出显著提高(F=12.81，P=0.0032＜0.01)；荧光染色结果亦说明siRNA可促进细胞凋亡的发生并提高其对紫外线(UV)照射的敏感性。 结论：成功建立siRNA抑制CSB表达的模型；siRNA抑制CSB表达后可有效降低HeLa细胞的增殖速度、促进细胞凋亡的发生并提高其对紫外线(UV)照射的敏感性；首次发现抑制CSB基因表达能提高细胞的自发凋亡率。本研究为深入研究CSB基因功能和开发其为抗肿瘤靶基因奠定了基础。
【学位单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：Q786
【部分图文】：

2.2siRNA对CSB基因表达的抑制作用2.2.IRT一PCR检测CSB转录水平分别提取转染SIRNA的HeLa细胞总RNA，检测CSB基因表达变化。图6为转染52一SIRNA，107一SIRNA，CN一SIRNA质粒后的各细胞CSB基因表达的mRNA的RT一PCR琼脂糖电泳图，条带大小无误;我们对CSB及ACT困条带进行了灰度定量分析(以ACT则为参照)，见表1，结果显示:转染52一SIRNA，107一SIRNA质粒可在转录水平有效抑制CSB表达，分别降低至阴性对照细胞的44.47%和53.52%。图6转染后的三组细胞CSBmRNA的Rr一PCR琼脂糖电泳图表1转染后的三组细胞CSBmRNA的RT一PCR电泳条带的灰度分析51RNACSBACTINCN一5iRNA1566.051154.252一51RNA107一SIRNA624.057731.1141034.221006.84CSB/ACTIN1

分别提取转染siRN.A的HeLa细胞总蛋白，检测CSB蛋白表达变化。图7为转染后的三组细胞CSB蛋白的W七Stemblot结果，由此可见:52一SIR封A，107一SIRNA质粒可抑制CSB蛋白在HeLa细胞中的表达。

为考察转染siRNA后细胞的增殖情况，我们分别对三组转染后的HeLa细胞绘制生长曲线。表2显示的是三组siRNA转染后细胞的增殖情况的统计数据，依据表2中的数据绘制生长曲线如图8。由图8可见，与阴性对照细胞相比，转染52一SIRNA，107一SIRNA质粒的细胞生长速度明显降低。由此可见CSB可能生长增殖调控等活动，并在其中发挥重要的作用。表2SIRNA生长曲线数据统计处理(x104)1OAY2OAY3OAY4DAYSDA丫6OAY7OAYNO.52一1NO.52一2NO.52一3平均值标准差0.5070.8160.5030.6910.5270.8290.5123330.0128580.7786670.0761991.6881.7131.751.7170.0311932.782.852.972.8666670.096093.373.293.23.296667.0702385.335.725.625.5566670.2025679.285102310.19.8716670.512209NO.107一1NO.107一2NO.107一3平均值标准差0.510.7760.5030.840.4930.9520.5()20.8560.0085440.0890841.8371.7381.761.7783330.0519843.272.953.343.1866670.1577784.084.214.134，140.0655746.3256.336.586，4116670.1458021211.6612.5812.080.465188NO.CN一10.491.1012.1633.984.7677.5315.42NO.CN一20.4931.111.8874.054.687.4916.04NO.CN一30.5131.18423.985.28.2316.63平均值0.4986671.1316672.0166674.0437484.8823337.7516.03标瞧差二0.012503.0。O斗55斗50.13日7530.040盛巧_一卫785断_0.416173__Q
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本文编号：2835389