利用琥珀抑制技术制备CVB3疫苗的初步研究

发布时间：2017-04-03 04:01

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【摘要】：琥珀抑制是指在翻译过程中抑制琥珀密码子(UAG)的终止信号,利用该项技术可以控制蛋白合成和扩展遗传密码。在此技术基础上发展的各项蛋白标记和蛋白操作技术已经成功应用到蛋白研究的各个方面,其中通过控制病毒蛋白合成而进行的病毒学研究促进了病毒认知和疫苗发展。柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B3, CVB3)是一类常见的感染人病毒,与常见的脊髓灰质炎病毒、肠病毒71型等同属小RNA病毒科-肠病毒属。一方面,CVB3的急性感染是导致病毒性心肌炎的主要原因,一部分患者可发展为扩张型心肌病；另一方面,越来越多的研究表明CVB3感染与I型糖尿病等慢性综合征相关。尽管CVB3感染危害众多,但是目前仍然没有有效的疫苗和针对性药物,临床患者只能对症治疗。本研究针对CVB3临床疫苗缺失,提出了利用琥珀抑制手段探究新型CVB3疫苗的研制思路,希望能探索出一种有效的CVB3完整病毒颗粒疫苗株制备方法。此思路的主要原理是,当在CVB3基因组开放阅读框中插入一个UAG琥珀密码子时,便形成了琥珀抑制依赖的CVB3：在人为控制下,该CVB3重组株通过表达识别UAG的aaRS/tRNA正交对,抑制琥珀信号,合成完整的活性病毒颗粒；而将前述CVB3病毒颗粒自然释放时,由于缺乏琥珀抑制系统,CVB3病毒并不能增殖。由此,具有与天然CVB3病毒颗粒结构完全相似却不能增殖的突变CVB3正是安全、优秀的疫苗候选物。为了通读重组病毒ORF中的UAG密码,我们构建了真核表达系统适用的琥珀抑制系统。首先,我们将从大肠杆菌E.coli中克隆的Tyr氨酰tRNA合成酶基因插入了真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点；紧接着,我们在CMV启动子上游的BglⅡ位点连续插入了四个E.coli来源的H1-tRNACUATyr,转录方向与CMV启动子方向相反以避免相互影响。为了验证构建的琥珀抑制系统的UAG通读效率,我们将EGFP的39位Tyr突变为UAG构建了质粒EGFP-Tyr39UAG。当该质粒与pcDNA3.1-EcYRS/tRNA共转染HEK 293T细胞时,可见绿色荧光；流式细胞术分析表达绿色荧光蛋白的细胞比例表明,与野生型EGFP相比,EGFP-Tyr39UAG通读效率达到了28.4%。通过定点突变技术,我们将CVB3 Nancy重组株的VP4蛋白的Tyr27定点突变为琥珀密码子UAG。通过T7依赖的体外转录,我们获得了带有突变位点的CVB3 Tyr27UAG的mRNA转录产物。将pcDNA3.1-EcYRS/tRNA与CVB3 Tyr27UAG的mRNA先后瞬时转染HEK 293T细胞,并未观察到可见的病毒引起的细胞病变。依据CVB3重组病毒需要盲传的经验,我们将CVB3 Tyr27UAG突变体培养物连续三次盲传入事先瞬转了pcDNA3.1-EcYRS/tRNA的293T细胞中。在第三次盲传时,发现了很少量的病毒引起的细胞病变。由此,我们利用琥珀抑制合成了具有增殖障碍(基因组起始部分有UAG终止信号)的CVB3病毒颗粒。总上,我们的工作是以CVB3为例,通过琥珀抑制技术研究小RNA病毒新型疫苗的报道,对以后CVB3等小RNA病毒颗粒在琥珀抑制、非天然氨基酸插入等方面的研究具有良好的借鉴意义。希望通过进一步发展和改良,琥珀抑制相关的各项技术为CVB3的疫苗研究做成贡献,也为应对突发病毒流行、快速制备疫苗提供一种可行性。
【关键词】：柯萨奇B病毒 琥珀抑制 大肠杆菌酪氨酸合成酶-tRNA 疫苗
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 缩略词表9-10
• 前言10-18
• 1 无义密码子的有义识别编码10-12
• 2 CVB3简述12-15
• 3 本课题的研究内容和意义15-18
• 第一章 琥珀抑制识别系统的构建表达18-38
• 1.1 材料、试剂及仪器18-22
• 1.1.1 材料来源和引物设计18-19
• 1.1.2 溶液配制19-20
• 1.1.3 试剂及耗材20-21
• 1.1.4 仪器设备21-22
• 1.2 研究方法22-29
• 1.2.1 构建pcDNA3.1-EcYRS/tRNA真核表达质粒系列22-24
• 1.2.2 克隆构建EGFP-Tyr39UAG琥珀抑制真核表达质粒24-25
• 1.2.3 实时荧光定量PCR鉴定EcTyrRS表达25-26
• 1.2.4 Western Blot鉴定EcYRSFlag表达26-28
• 1.2.5 共转染EcYRS/tRNA和EGFPY39UAG28
• 1.2.6 流式细胞术分析EGFP表达情况28-29
• 1.3 研究结果29-35
• 1.3.1 成功构建pcDNA3.1-EcYRS29-30
• 1.3.2 成功构建pcDNA3.1-EcYRS/tRNA真核表达质粒系列30
• 1.3.3 EcYRS/tRNA过表达正常30-32
• 1.3.4 成功构建EGFP-Tyr39UAG32
• 1.3.5 琥珀抑制效率分析32-35
• 1.4 讨论35-36
• 1.5 小结36-38
• 第二章 CVB3琥珀抑制突变体的构建及表达38-52
• 2.1 材料、试剂及仪器40-41
• 2.1.1 质粒来源和引物设计40
• 2.1.2 溶液配制40
• 2.1.3 试剂及耗材40-41
• 2.1.4 仪器设备41
• 2.2 研究方法41-45
• 2.2.1 pCE-UAG突变体克隆构建41-42
• 2.2.2 体外转录42-44
• 2.2.3 RNA电泳44
• 2.2.4 共转染 pCE RNA 与 EcYRS/tRNA44-45
• 2.2.5 RTCA评价细胞毒性45
• 2.3 研究结果45-49
• 2.3.1 成功构建并转录pCE突变体45-47
• 2.3.2 共转pCE-UAG与EcYRS/tRNA引起病毒CPE47-49
• 2.4 讨论49-50
• 2.5 小结50-52
• 结论与展望52-54
• 主要结论52
• 工作展望52-54
• 附录A54-57
• 附录B57-58
• 参考文献58-64
• 攻读硕士期间发表的文章64-66
• 致谢66-67

【参考文献】

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1 赵文然;钟学宽;张淑娟;沃晓Z，

本文编号：283653