抗甲状旁腺激素纳米抗体及吸附剂的制备

发布时间：2017-04-03 05:17

  本文关键词：抗甲状旁腺激素纳米抗体及吸附剂的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)作为一种中分子毒素在慢性肾衰竭患者特别是终末期肾衰竭患者体内积累超过普通人数十倍,导致患者出现骨折、肌痛、贫血等临床症状,严重影响了患者的生存质量。因此,终末期慢性肾衰竭患者体内过量PTH的去除工作具有十分重要的临床意义。纳米抗体因为其分子量小、亲和力好、稳定性好、免疫原性低和能够到达很多抗体难以到达的表位而得到广泛研究。因此,本论文研究了纳米抗体作为血液净化吸附剂配基去除PTH的可能性。1.表达宿主的选择。将两种纳米抗体W2和W49在四种E.coli宿主BL21(DE3)、OrigamiTM2(DE3)、Rosseta-gamiTM(DE3)、Shuffle T7 Express中进行表达,根据可溶表达量,最终选择BL21(DE3)和Shuffle T7 Express两种宿主表达W49,Shuffle T7 Express表达W2。W49在BL21(DE3)中的表达量为553.3 mg/L,在Shuffle T7 Express中的表达量为272.3 mg/L；W2在Shuffle T7 Express中的表达量为133.2 mg/L。2.纳米抗体的分离纯化。细胞破碎并离心去沉淀后,利用固定化金属离子螯合层析一步纯化获得纯度高于90%的W49,其在BL21(DE3)和Shuffle T7 Express中的回收率分别为62%和58%。利用固定化金属离子螯合层析并结合强阴离子交换两步层析获得纯度高于90%的W2,总回收率为46.5%。3.纳米抗体与PTH的相互作用。用ELISA、ITC、SPR等方法研究了W2、W49分别与PTH的相互作用。结果表明W2能够结合PTH,亲和常数约为5～6×10-7 M,而W49不与PTH相互作用。4.吸附剂的制备与吸附性能研究。固载W2在Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶上,配基密度为9.9 mg/mL。Sepharose CL-6B-W2吸附剂对PTH的静态吸附最大结合容量为1.8 mg/mL,动态结合容量为0.98 mg。0.1 M GIy-HCI(pH=2.0)条件下洗脱率为67.3%。Sepharose CL-6B-W2吸附剂对人血清白蛋白几乎无吸附作用,而对人免疫球蛋白存在少量结合。总之,通过本论文的研究,获得了对PTH具有去除效果的免疫吸附剂,为利用纳米抗体制备吸附剂吸附去除血液中PTH提供了理论基础。
【关键词】：蛋白纯化 甲状旁腺激素 纳米抗体 吸附剂
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文献综述11-20
• 1.1 慢性肾衰竭与中分子11-12
• 1.1.1 慢性肾衰竭11
• 1.1.3 中分子11-12
• 1.2 甲状旁腺激素12-14
• 1.2.1 甲状旁腺激素概述12
• 1.2.2 PTH的去除12-14
• 1.3 纳米抗体技术14-17
• 1.3.1 纳米抗体(Nb)的发现及结构特征14-15
• 1.3.2 纳米抗体的应用15-16
• 1.3.3 纳米抗体的表达16-17
• 1.4 血液净化吸附剂17-19
• 1.4.1 血液净化技术17-18
• 1.4.2 血液净化吸附剂18-19
• 1.5 本论文研究目的、内容和意义19-20
• 2 抗PTH纳米抗体的表达和纯化20-40
• 2.1 引言20
• 2.2 实验材料与仪器20-23
• 2.2.1 材料与试剂20-22
• 2.2.2 主要仪器、耗材22-23
• 2.3 实验方法23-30
• 2.3.1 制备感受态细胞23-24
• 2.3.2 重组质粒的转化24-25
• 2.3.3 重组蛋白的表达25
• 2.3.4 菌体破碎25-26
• 2.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色26-27
• 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳27
• 2.3.8 固定化金属离子亲和层析27-28
• 2.3.9 强阴离子交换层析28-29
• 2.3.10 重组蛋白纯度分析及回收率计算29
• 2.3.11 BCA法测定总蛋白含量29-30
• 2.3.12 超滤30
• 2.4 实验结果与讨论30-38
• 2.4.1 重组蛋白的表达30-32
• 2.4.2 重组蛋白的可溶性检测32-33
• 2.4.3 固定化金属离子亲和层析分离纯化蛋白33-37
• 2.4.4 强阴离子交换层析纯化目的蛋白37-38
• 2.5 小结38-40
• 3 抗PTH纳米抗体的亲和活性检测40-50
• 3.1 引言40
• 3.2 实验材料40-42
• 3.2.1 材料与试剂40-41
• 3.2.2 主要仪器与耗材41-42
• 3.3 实验方法42-45
• 3.3.1 酶联免疫吸附测定42
• 3.3.2 等温滴定量热法42-43
• 3.3.3 表面等离子共振43-45
• 3.4 实验结果及讨论45-49
• 3.4.1 酶联免疫吸附测定45
• 3.4.2 等温滴定量热法45-47
• 3.4.3 表面等离子共振47-49
• 3.5 小结49-50
• 4 吸附剂的合成及其吸附性能研究50-61
• 4.1 引言50
• 4.2 实验材料50-51
• 4.2.1 材料与试剂50
• 4.2.2 主要仪器与耗材50-51
• 4.3 实验方法51-58
• 4.3.1 吸附剂的合成51-53
• 4.3.2 环氧密度和活化羧基密度的测定方法53-56
• 4.3.3 Bradford法测定吸附剂吸附蛋白情况56-57
• 4.3.4 吸附剂亲和常数测定57
• 4.3.5 吸附剂动态结合容量测定57-58
• 4.3.6 吸附剂对HSA的吸附58
• 4.3.7 吸附剂对IgG的吸附58
• 4.4 实验结果及讨论58-60
• 4.4.1 吸附剂的合成58
• 4.4.2 吸附剂亲和常数测定58-59
• 4.4.3 吸附剂对PTH动态结合容量测定59-60
• 4.4.4 吸附剂对HSA的吸附60
• 4.4.5 吸附剂对IgG的吸附60
• 4.5 小结60-61
• 结论61-62
• 展望62-63
• 参考文献63-67
• 附录A 重组蛋白PTH(1-84)氨基酸序列67-68
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况68-69
• 致谢69-70

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