A族链球菌多价表位疫苗的完善制备及其动物免疫保护作用的相关研究

发布时间：2017-04-03 07:19

  本文关键词：A族链球菌多价表位疫苗的完善制备及其动物免疫保护作用的相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:A族链球菌(group A streptococcus,GAS)是一种常见的革兰氏阳性菌,可以引起多种侵袭性感染和自身免疫性疾病。在大多数发展中国家GAS感染导致的风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎等仍然是严重威胁人们生活质量的一大问题。而对于GAS感染的治疗目前大多为青霉素、大环内酯类药物或静脉注射免疫球蛋白,但由于耐药性或保护作用短暂等原因致使GAS感染仍旧保持着很高的复发率。所以制备成功有效的GAS疫苗成为GAS预防和治疗的研究热点。本室前期已构建了包含7个Fba A表位和M蛋白1、3、6、18血清型的与人无交叉反应的部分基因及M蛋白的C端共同基序(J基因)的p ET28a/F7M5[1],但是根据近期新的流行病学调查显示,我国大部分地区GAS流行菌株中M12血清型占了一大部分。故本实验在本室构建好的质粒的外源基因序列上插入M12与人无交叉反应的基因片段并表达,该蛋白命名为F7M6,又以其为模板构建表达了只含有6个不同M蛋白血清型的基因片段,该蛋白命名为M6。将F7M6蛋白,M6蛋白和本室保存的M1全长蛋白(简称M蛋白)分别免疫小鼠,通过ELISPOT、ELISA等实验技术观察细胞免疫和体液免疫效果,并攻毒后计算存活率,以确定疫苗保护效果。方法:1利用生物信息学方法在美国疾病预防和控制中心(CDC)数据库获GAS M12血清型的基因序列,通过与人体组织基因比对选取与人无交叉反应的特异性序列,采用搭桥PCR的方法扩增并插入F7M5序列中,得到F7M6序列。2在线预测F7M6序列表位。3在线预测F7M6蛋白空间结构和亲水性分析。4以F7M6序列为模板,PCR扩增出含有M蛋白1、3、6、18、12血清型和M蛋白C端共同基序(J基因)的基因序列,得到M6序列。5将两段基因片段克隆至载体p ET28a中,测序正确后将阳性质粒分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,SDS-PAGE电泳观察结果,Western blot鉴定。采用亲和层析纯化方法对两种蛋白进行纯化。6将纯化的两种蛋白,连同本室保存的GAS M蛋白,以相同剂量联合佐剂分别免疫小鼠,腹部皮下多点注射,同时设立PBS对照组。每组12只,20μg/每只;免疫间隔21天,共免疫4次;于每次免疫10天后下颌窦静脉取血,分离血清,-80oC保存备用。7末次免疫后10天,处死6只小鼠,ELISPOT检测小鼠脾脏免疫细胞表达IL-4和IFN-γ的水平,ELISA检测各组血清中Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平及动态变化。8用ELISA法检测临床获取的抗链“O”阳性和健康儿童血清与F7M6蛋白的特异性结合能力。9采用全菌ELIAS法,检测临床获取的GAS菌株与F7M6组血清的结合能力。10用致死量的M1GAS腹腔攻击各组剩余下的6只小鼠,观察并计算各组存活率。结果:1成功构建了p ET28a/F7M6、p ET28a/M6阳性质粒,并成功表达蛋白。Western blot结果显示两种蛋白均可以与F7M5抗体杂交。2 ELISA检测各组血清,结果显示,随免疫次数增加,Ig G水平逐渐增高,F7M6组效价达到1:669309,M6组效价达到1:58158,M蛋白组达到1:32980,。F7M6组显著高于M6组和M蛋白组(P0.001),但M6组和M蛋白组间无统计学差异。3血清Ig G1和Ig G2a检测结果显示,三组均可诱导较高水平的相应抗体,均显著高于PBS组(P0.001),Ig G1各组间没有显著差异,Ig G2a水平则F7M6组显著高于M6组(P=0.009),但F7M6组与M蛋白组、M6与M蛋白组间没有差异。4 ELISPOT结果显示,IL-4,IFN-γ水平:F7M6、M6和M蛋白组均显著高于PBS组(P0.001),且F7M6组的水平最高,而M蛋白组高于M6组(P0.05)。5用F7M6蛋白作为诊断抗原检测抗链“O”阳性的病人血清及健康人血清,结果显示,抗链“O”阳性的病人血清,阳性检出率为(95%),而健康儿童血清的阳性率为(47.3%),二者差异具有统计学意义(P0.005)。6 ELISA检测4株临床株于不同组的血清的结合能力,结果显示F7M6均能与其结合。7攻毒后,F7M6、M6和M蛋白各组生存率分别为66.7%、33.3%和66.7%,PBS组全部死亡。统计分析显示各实验组均高于PBS组(P0.05)。结论:1成功构建并表达F7M6和M6蛋白。2 F7M6、M6和M蛋白免疫小鼠后均可引起较好的细胞免疫和体液免疫应答,对GAS感染有保护作用,以F7M6效果最佳,并且F7M6的多价表位涵盖了时下流行的大部分GAS的血清型。
【关键词】：A族链球菌(GAS) 多表位疫苗 M蛋白 FbaA蛋白 免疫应答
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 第一部分 多价表位疫苗的设计构建与表达12-33
• 前言12-13
• 材料与方法13-27
• 结果27-28
• 附图28-31
• 讨论31-33
• 第二部分 重组多价表位疫苗的免疫作用的研究33-47
• 前言33
• 材料与方法33-38
• 结果38-40
• 附图40-45
• 讨论45-47
• 结论47
• 参考文献47-50
• 综述50-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 个人简历59

【参考文献】

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1 梁云梅;常贺生;沈叙庄;黄国英;郑跃杰;符洲;俞桑洁;袁林;杨永弘;;致儿童咽扁桃体炎酿脓链球菌emm分型[J];临床儿科杂志;2011年04期

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本文编号：283945