miR-17-5p靶向自噬相关蛋白ATG7调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染作用的研究

发布时间：2020-10-14 06:36

　　 目的:通过研究miR-17-5p对自噬相关基因ATG7的靶向调控机制和对细胞自噬的作用,探究miR-17-5p在结核分枝杆菌介导的自噬途径中的作用及其机制。方法:生物信息学分析得到miR17-5p的靶基因ATG7,通过成功构建载体ATG7野生型(p Mir GLO-ATG7-3'UTR-WT)和突变型,利用双萤光素酶报告系统、Western blot验证miR-17-5p和ATG7的靶向关系,同时构建结核分枝杆菌(H37Ra)感染的人源性THP-1巨噬细胞模型,将做不同处理的细胞分为三组:miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor、miR-17-5p nc。通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测H37Ra感染对miR-17-5p表达量的影响,并且进一步通过Western blot、免疫荧光观察检测LC3蛋白的表达量和自噬小体的数量。结果:MTB感染能够引起miR-17-5p的下调,随着感染复数的增加有明显的降低。而生物信息学预测结果显示miR-17-5p与ATG7具有靶向性,双萤光素酶报告实验、Western blot验证miR-17-5p能够和ATG7靶向结合,并对其进行负调控。进一步通过Western blot、免疫荧光观察发现miR-17-5p mimics组LC3Ⅱ的表达下调,自噬小体表达降低,而miR-17-5p inhibitor组相反。其中对H37Ra感染组与未感染组之间比较,ATG7和LC3Ⅱ蛋白表达明显增强。结论:miR-17-5p直接靶向结合ATG7 3'UTR抑制自噬,在巨噬细胞抗MTB过程中发挥作用。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 细胞培养与诱导分化
        1.2.2 构建结核分枝杆菌感染的THP-1巨噬细胞模型
        1.2.3 脂质体转染THP-1
        1.2.4 microRNA表达量的检测
        1.2.5 miR-17-5p相对表达水平的检测
        1.2.6 生物信息学预测靶基因
        1.2.7 载体构建
        1.2.8 双萤光素酶报告系统分析
        1.2.9 ATG7和LC3蛋白表达水平的检测
        1.2.1 0 激光共聚焦显微镜观察细胞免疫荧光
    1.3 统计学分析
2 结果
    2.1 H37Ra感染THP-1细胞后miR-17-5p的表达情况
    2.2 载体构建及测序结果验证
    2.3 miR-17-5p对ATG7的靶向性验证
    2.4 miR-17-5p对自噬流及自噬小体形成的作用
3 讨论

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本文编号：2840326