Dok5促进GDNF诱导PC12-GFRa1-RET细胞分化

发布时间：2020-10-15 05:37

　　 酪氨酸蛋白激酶(Protein Tyrosine Kinase，PTK)是存在细胞膜或细胞浆中的蛋白激酶，它具有典型的羧基端催化区，当被激活后可以将其底物以及自身的酪氨酸残基磷酸化。Doks(downstream of tyrosine kinase)是一类新近发现的存在于胞浆中的与酪氨酸激酶相关的信号分子，可以作为PTK直接底物分子而被磷酸化；含有多个与其它分子相互作用的信号域或氨基酸基序，具有典型的细胞内分子接头特征。 胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是一种新型神经营养因子，属于TGF-β超家族成员，1993年由Lin等首先从大鼠B49细胞系的上清中分离纯化得到的。GDNF的神经营养作用主要是通过两类受体亚基介导，即胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRas)亚基和受体酪氨酸激酶RET(rearranged during transfection)亚基。2001年Grimm等人利用酵母双杂交发现了Dok5分子与c-Ret在多种神经组织中共表达，作为其底物而介导PC12细胞的突起生长，相对于Dok1而言Dok5不与RasGAP和Nck相互作用，却能增强c-Ret依赖性的MAPK激活，因此，Dok5分子在GDNF对多巴胺能神经元、运动神经元、感觉神经元、交感神经元等多种神经元促进分化、存活和损伤保护作用中可能发挥重要的作用。 本研究采用基因真核细胞转染技术来分析Dok5分子在GDNF诱导PC12-GFRal-RET细胞分化中的作用。首先克隆并成功构建pEYFP-N1-Dok5真核表达质粒；转染已经建立的基因工程细胞，进行定位分析；然后进行分化测定，最后分析其促进分化的机制。我们从表达定位、促分化作用以及作用机制三个角度对Dok5的功能进行了初步研究。 研究主要内容与结果如下： 一、pEYFP-N1-Dok5及pcDNA3.1(+)-Dok5真核细胞表达质粒的成功构建及在PC12-GFRa1-RET细胞中的定位。 应用分子生物学技术构建融合蛋白表达质粒pEYFP-N1-Dok5以及真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Dok5。采用阳离子脂质体转染方法将pEYFP-N1-Dok5转入PC12-GFRal-RET细胞，在Olympus BX60荧光显微镜和Metamorph软 中文摘要 件组成的图像处理系统上进行荧光观察转染成功细胞，GDNF刺激下Doks转 染的细胞发出的荧光在周边增强，而pEYFP一Nl转染以及PcDNA3.1(+)- Doks与pEYFP一Nl共转染的细胞则不明显。 二、Doks对GDNF诱导的PC12一GFRal一RET细胞分化有促进作用。 对照组pEYFP一Nl，实验组pEYFP一Nl一Doks、pEYFP一Nl一Dokl(实验室已 有)分别转入 PC12一GFRal一RET细胞，GDNF作用4一5天，在Olympus BX6o 荧光显微镜和Metamorph软件组成的图像处理系统上进行荧光观察荧光细胞 并计数，结果发现pEYFP一Nl一Doks组具有明显的促进分化作用，而pEYFP- Nl一Dokl组具有明显的抑制分化作用。 以pEYFP一Nl与peDNA3.1共转染作为空白对照组，pEYFP一Nl与Doks- pcDNA3.1共转染作为实验组，以同样方法处理细胞，结果依旧提示Doks促进 GDNF诱导的PC12一GFRal一RET细胞的分化。 三、分析Doks促进GDNF引起的PC12一GFRal一RET细胞分化作用的机 制。 按照上述转染方法，在转染成功的细胞培养液中分别加入MEK抑制剂 PD，PI3K抑制剂LY以及Src抑制剂PP:各15分钟，再加入GDNF培养4一5 天，再以上述的方法观察和计数，结果表明抑制作用如下:PPZPDLY，三组 与GDNF组均有差别，提示，Doks非特异的通过PI3K，MEK一MAPK以及Sre 介导的分化通路促进GDNF诱导的PC12一GFRal一RET细胞分化。 本实验结果表明，受体酪氨酸激酶底物分子Deks能通过PI3K，MEK- MAPK，Src通路非特异的促进胶质细胞源性神经营养因子诱导PC12一GFRal- RET细胞的分化。
【学位单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R346
【文章目录】：
1 前言
2 材料与方法
    2.1 实验材料
    2.2 实验方法
3 结果
1-Dok5的获得'>    3.1 pEYFP-N₁-Dok5的获得
    3.2 pcDNA3.1（+）-Dok5的获得
    3.3 Dok5在PC12-GFRal-RET细胞中的表达及定位
    3.4 Dok5促进GDNF诱导的PC12-GFRal-RET细胞的分化
    3.5 Dok5促进GDNF诱导的PC12-GFRal-RET细胞分化的机制
4 讨论
    4.1 DOK5的克隆，表达以及定位
    4.2 Dok5促进GDNF诱导PC12-GFRal-RET细胞分化作用
    4.3 Dok5促进GDNF诱导的PC12-GFRal-RET细胞分化的机制
5 结论
附录
参考文献
致谢
文献综述

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本文编号：2841776