表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶抑制剂筛选模型建立

发布时间：2020-10-15 23:15

　　 表皮生长因子受体（EGFR）属于一种酪氨酸蛋白激酶(TPK)，当EGFR与其配体EGF结合后导致二聚化并激活内在的TPK活性，催化胞内域受体自身磷酸化以及下游底物磷酸化，引发信号传递途径，从而调控细胞增殖和凋亡。除了调节正常细胞的生长外，EGFR在多种癌细胞中高表达，这种过表达增强了TPK活性，而且与恶性肿瘤的发生和发展密切相关。因此，建立EGFR/TPK抑制剂筛选方法或模型对于寻找和研究抗肿瘤药物具有重要价值。本论文首先1)从高表达EGFR的乳腺癌细胞中提取细胞膜作为TPK来源，用构建的GST-C25融合蛋白（包含谷胱甘肽-S-转移酶和EGFR羧基端自身磷酸化位点的25个氨基酸）作为反应底物，同时加入EGFR/TPK抑制剂AG1478，采用 Western blot 技术检测了细胞膜EGFR/TPK活性，以此建立了EGFR/TPK活性测定方法。测定结果表明，从乳腺癌细胞中提取的细胞膜EGFR可催化底物GST-C25融合蛋白磷酸化，加入AG1478，底物的磷酸化被抑制。在以Western blot技术建立的EGFR/TPK活性检测基础上，进一步2)建立了用于高通量筛选（HTS）的时间分辨荧光免疫检测法（TRFIA）：制备微量的乳腺癌细胞膜EGFR和配体EGF以及底物GST-C25的微量反应体系，并将其加入预先包被抗GST抗体的微孔板内，抗GST抗体与底物GST-C25结合并固定在微孔板上，再加入铕标记抗酪氨酸磷酸化抗体（Eu-antiPY20）使之与GST-C25磷酸化的基团特异结合，洗去多余的抗体，在荧光增强溶液的作用下测定铕3+(Eu3+ )的荧光强度，以荧光的强弱确定EGFR/TPK活性的高低。结果显示，激活的EGFR/TPK 催化底物GST-C25磷酸化，其荧光强度增加，而未激活或加入抑制剂的EGFR/TPK荧光强度减弱，表明EGFR/TPK活性随荧光强度增加而升高，加入抑制剂后EGFR/TPK活性下降，荧光强度随之减弱。本论文的最后部分3)利用已经建立的高通量筛选 WP=7 模型结合Western blot技术对100余种中药提取物分别进行了初筛和复筛，结果发现4种中药提取物显著抑制乳腺癌细胞的EGFR/TPK活性，这为中药EGFR/TPK抑制剂的研究和开发奠定了基础。与常规的同位素方法相比，本论文建立的高通量TRFIA筛选模型操作更简便和安全，细胞膜提取物直接作为EGFR激酶来源，使操作成本大大降低，Eu3+以及荧光增强溶液的使用也增加了检测的灵敏度，选择EGFR-羧基端自身磷酸化位点的25个氨基酸作为底物，增加了TRFIA检测的特异性，该方法不仅适用于合成的单体化合物筛选，也适用于中药以及其它天然来源的粗提取物筛选。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R363
【文章目录】：
符号说明
中文摘要
英文摘要
前 言
第一部分 EGFR/TPK检测模型的建立
第二部分 EGFR/TPK高通量筛选模型的建立
第三部分 筛选模型的应用
小 结
参考文献
综述一 细胞周期与抗肿瘤治疗展望
综述二 细胞周期与肿瘤治疗的关系
论文及综述发表情况
致 谢

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 葛高翔,吴静,林其谁;表皮生长因子受体体外测活的非同位素方法[J];科学通报;2000年22期

2 吕根法,李文维,伍津津;银屑病皮损内酪氨酸蛋白激酶活性的初步研究[J];中华皮肤科杂志;2000年02期

本文编号：2842384