Smurf1通过抑制LKB1的多聚泛素化而调控其蛋白稳定性

发布时间：2020-10-25 01:52

　　 目的:为了探寻肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1)的上游调控分子,并研究其对LKB1的影响。方法:首先,利用UbiBrowser数据库预测LKB1可能的上游调控分子,并根据评分筛选出可能对LKB1具有调控作用的Smurf1基因。然后,构建Smurf1和LKB1相关过表达质粒,并转染HEK293T细胞,通过Western blot检测LKB1蛋白质表达的变化。最后,运用荧光定量PCR(qPCR)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)探索Smurf1调控LKB1可能的分子机制。结果:①成功构建LKB1和Smurf1相关过表达质粒。②在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的野生型Smurf1时其对应的LKB1蛋白相对表达量分别为0.026 2±0.000 7、0.072 7±0.000 3、0.130 1±0.001 3、0.431 5±0.001 0。经单因素方差分析,其结果为F=79 636.433,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。③在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的突变型Smurf1时其对应的LKB1的蛋白相对表达量分别为0.018 0±0.000 1、0.053 0±0.000 4、0.125 0±0.001 0、0.200 4±0.001 7。经单因素方差分析,其结果为F=12 887.993,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。④以GAPDH为内参,未过表达Smurf1组和过表达Smurf1组中,LKB1的相对mRNA表达水平分别为1.085 1±0.412 5、2.398 2±1.766 9。经独立样本t检验统计分析,P=0.257。⑤以β-actin为内参,未经Smurf1处理组、野生型Smurf1(WT)处理组、突变型Smurf1(C699A)处理组中LKB1的相对泛素化水平分别为1.823 8±0.027 8、0.088 1±0.005 1、0.212 7±0.006 2。经单因素方差分析,其结果为F=6 721.953,P=0.000。与未经Smurf1处理组相比,进一步采用LSD-t法分析,野生型Smurf1组和突变型Smurf1组各组P值分别为0.000和0.000。结论:这些结果表明Smurf1通过降低LKB1的多聚泛素化从而参与其蛋白稳定性的调节。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞、质粒、菌株
    1.2 主要试剂
    1.3 真核表达质粒的构建
    1.4 细胞培养与转染
    1.5 Western blot及Co-Immunoprecipitation检测相关蛋白表达
    1.6 细胞总RNA提取和逆转录
    1.7 q RT-PCR
    1.8 统计分析方法
2 结果
    2.1 利用Ubibrowser数据库探寻LKB1上游调控分子
    2.2 真核过表达质粒的构建和鉴定
    2.3 Smurf1上调了LKB1表达并增强了LKB1的稳定性
3 讨论

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