利用长距离PCR扩增国内肠道病毒流行株基因组方法的建立和评价

发布时间：2020-10-26 04:28

　　 目的:通过调查近年来我国肠道病毒EV-71型和柯萨奇病毒A16型流行株的全基因组序列,建立一种能够获得我国肠道病毒序列的通用扩增方法,为今后的手足口病流行病学分析、致病机理研究等打下基础。方法:收集我国近5年各地报道的肠道病毒流行株全基因组序列作为参考序列进行比对分析,在保守区设计通用引物,利用3'RACE、长距离PCR扩增及简并引物扩增肠道病毒全基因组序列,采用Ion Torrent PGM二代测序仪对扩增产物进行深度测序,以对扩增方法进行验证和评价。结果:通过比对肠道病毒流行株序列设计了通用扩增引物,经二代测序实验获得了肠道病毒全基因组序列;以系列比例模拟混合病毒感染,该扩增方法能够同时获得2株肠道病毒的全基因组序列;能够完整地揭示肠道病毒重组情况。结论:建立了针对我国近年来肠道病毒流行株的通用全基因组扩增方法,在病毒培养液中肠道病毒的提取与扩增中显示了较高的灵敏度,能够反映混合病毒感染、重组病毒的情况。
【部分图文】：

生物技术通讯LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.30No.3May,2019增造成了诸多困难，主要体现在：在传统的分段设计引物时，肠道病毒可能在引物的设计位点发生突变，导致引入突变或引物失效；混合肠道病毒感染情况时引物设计位点含有核酸多态性，特异性引物可能导致混合病毒序列信息的丢失；针对每一株肠道病毒或一批流行株肠道病毒进行引物设计与合成不仅耗费了人力物力，也对试剂和成本造成浪费。因此，我们设计了一系列通用扩增引物，能够涵盖近年来国内暴发的肠道病毒流行株，获得全基因组序列。在肠道病毒暴发流行中，EV-71型和CV-A16型为主要出现的病原体，这2种病原体在每年大流行中共同交替与进化[14-15]，在临床诊断和深入研究中，出现了患者混合肠道病毒感染的情况以及肠道病毒重组感染的情况。我们分别对这2种临床可能出现的情况进行了模拟与验证，结果显示我们建立的方法具有分辨混合病毒感染的能力，且通过二代测序的序列读数数量可大概推算2种混合肠道病毒的比例；重组肠道病毒的全序列扩增也同样能够得到真实反映。我国每年暴发的肠道病毒流行株可能不尽相同，若每年根据肠道病毒流行株的分型信息设计特异性引物，将消耗很大的人力物力，并造成试剂和经济的浪费。我们通过将建立的肠道病毒全基因组序列扩增方法与二代测序技术相结合，节省了连接载体后测序等一系列步骤，节约了科研时间，也为进一步的生物信息学研究提供了准确、足量的数据。参考文献[1]LiuW,WuS,XiongY,etal.Co-circulationandgenomicrecombinationofcoxsackievirusA16andenterovirus71duringalargeoutbreakofhand,foot,andmouthdiseaseinCentralChina[J].PLoSOne,2014,9(4):e96051.[2]YipCC,LauSK,ZhouB,etal.Emergen
【参考文献】

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本文编号：2856492