MMP-28催化结构域的表达和复性

发布时间：2020-10-29 14:52

　　 侵袭和转移是恶性肿瘤的显著特征,肿瘤细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的降解是肿瘤侵袭转移的关键步骤之一。ECM是存在于细胞与细胞之间的结缔组织, 由多种蛋白质和非蛋白成分组成,构成细胞生活的微环境,以前认为它只能起到细胞与细胞的连接,营养,防御,保护与支持作用,并无其它重要功能。自1962年Gross和Lapiere首先报导胶原酶（collagenase）以来,作用于ECM其它成分的蛋白酶相继被报导。目前证实ECM不仅参与多种细胞的生理过程,如：细胞的迁移、分化、增殖、生殖等过程。而且还参与炎症、肿瘤浸润、转移等病理过程,是细胞和细胞之间信号传递的桥梁。ECM的降解主要依靠蛋白水解酶的作用。根据酶的结构和功能的特点,蛋白水解酶可分为六类：脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,简称MMP)。如今越来越多的证据表明,肿瘤细胞侵袭转移的能力与其产生或诱导基质金属蛋白酶的能力密切相关。所以降解ECM的MMPs已成为目前研究的焦点。 基质金属蛋白酶家族是指一系列生理情况下可降解细胞外基质及基底膜的锌离子依赖性内肽酶的总称。这些锌离子依赖性内肽酶通常由纤维母细胞，中性粒细胞，巨噬细胞及肿瘤细胞产生。MMPs家族中已经被发现的成员有23余种之 WP=56 多，尽管它们大小不同,底物也不尽相同,但所有的MMPs都含有至少三个相似的结构域将其与其它金属蛋白酶区分开。自氨基端到羧基端依次为：信号肽结构域(signal domain)、前肽结构域(propeptide domain)和催化结构域(catalytic domain)。信号肽结构域由17～29个氨基酸组成。紧接着的前肽结构域是由77～87个氨基酸组成的,这个结构域中存在一个高度保守的氨基酸序列：ＰＲＣＧＶＰＤ,其中的半胱氨酸对酶原形式的维持起重要作用,在酶原的激活过程中,这个结构域就会被水解掉。在所有催化结构域中都含有一段十分保守的氨基酸序列：ＨＥＸＧＨＸＸＧＸＸＨ,其中的三个组氨酸被认为可以与酶活性中心部位Zn2＋结合而形成配位键,从而对酶的催化活性起重要作用。除了MMP—7以外,其他所有MMP在羧基末端都含有一个血结合素样结构域(hemopexin),关于这个结构域的功能还没有完全搞清楚,它可能介导MMPs与前肽结构域、ECM成分或与MMP抑制剂的结合。 根据MMPs的结构特点、生化特征以及作用底物可以将MMPs分为5种类型：间质性胶原酶(Interstitial Collagenase)、间质溶素(Stromelysin)、 明胶酶(Gelatinase)、膜型金属蛋白酶(Memberane-type MMPs, MT—MMPs)、新型MMP。 MMPs家族成员都存在以下五个基本特性： ① 都以酶原的形式分泌到ECM中,并在适当条件下在该部位被激活而发挥生理作用。 活性都依赖于Zn2＋的存在,Ca2＋对其活性及稳定性也起到一定的作 用。 结构上具有40%～50%的同源性。 ④ 在体内存在它们的天然激活剂和抑制剂(MMPs组织抑制因子TIMPs及血浆抑制因子α2 巨球蛋白)。 一般认为活化型 MMPs与其组织抑制因子1∶1比例的结合将导致MMP功能的抑制。 ⑤ 至少能水解一种ECM成分。 MMPs存在方式有前酶型、活化酶型以及与组织抑制因子结合的复合物型。MMPs的存在形式以何种及何型为主与肿瘤的种类及恶性程度密切相关。MMPs的产生及活化通常在4个水平上调节： WP=57 基因转录水平。 蛋白合成水平。 无活性酶前体经蛋白水解酶的作用而激活。 特异性抑制因子的作用。 其中近年的研究热点集中在后两个方面，本实验目的即为表达并且复性出具有生物学活性的MMP—28而为今后筛选其特异性抑制因子做好准备。 MMPs在胎儿形成、排卵、创伤愈合等过程中起着重要的作用, 功能主要有：降解细胞外基质膜有效成分、调节细胞粘着、作用于细胞外组分或其他蛋白成分而启动潜在的生物学功能、直接或间接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程。MMPs是ECM重建或降解的生理、病理过程中很重要的酶,是去除细胞迁移屏障的关键酶。MMPs通过分解ECM成分来调节其降解和重组之间的动态平衡,以达到消除某些特殊信号、显现某些隐含信号、甚至使基质中已存在的生物活性物质释放或激活的目的,进而参与细胞和组织器官的各种形态和功能变化。这些变化既包括各组织和细胞的生长、增殖、分化;生殖过程中子宫内膜的周期性变化、排卵、胚泡着床等生理变化，也包括肿瘤细胞的浸润和转移,炎症的发生及扩散等病理变化。 MMPs直接作用于细胞的粘附和迁移,而ECM降解的总量是由活化的MMPs和其抑制因子TIMPs的总量的平衡来严格控制的。MMPs各成员之间、MMP与其它蛋白水解酶之间存在着密切的联系,构成了严密的调节网络。正是该调节机制的精确性,保证了机体内生理状态下细胞的迁移和细胞外基质的重建。而调节的失控则成为肿瘤细胞侵袭和转移等病理过程发生的原因。同时，MMPs的过量表达和活化与癌症、风湿性关节炎、肺气肿、动脉粥样硬化、角膜溃疡、牙周炎等很多疾病有关。在肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中都有MMPs活性的显著增加。国内外相当多的研究集中在疾病病理的发生与发展,特别是肿瘤的侵袭与转移。在肿瘤细胞中，MMPs的表达水平明显高于正常细胞，它们能促进肿瘤细胞的生长、分
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2004
【中图分类】：Q55
【部分图文】：

ＥＸＧＨＸＸＧＸＸＨ,其中的三个组氨酸被认为可以与酶活性中心部位 Zn2＋合而形成配位键,从而对酶的催化活性起重要作用。除了 MMP—7 以外,其他所 MMP 在羧基末端都含有一个血结合素样结构域(hemopexin domain),关于这个构域的功能还没有完全搞清楚,它可能介导 MMPs 与前肽结构域、ECM 成分或与MP 抑制剂的结合。 (图 1.1)

肿瘤形成过程中MMPs在肿瘤生长、血管生成、肿瘤侵蚀转移及细胞程

动阶段中具有一定的作用。本实验即采用大肠杆菌表达系统，以包重组 MMP-28。包涵体形式表达重组蛋白具有以下优点：蛋白表达量高，在每升大肠杆菌培养物中最多可达总蛋白量的30蛋白。表达的蛋白大多数不会被宿主细胞水解酶所降解。在宿主细胞裂解和初步纯化过程中，凝聚的包涵体没有生物学活的目的蛋白不会失活。利用离心，过滤或者凝胶层析的方法可以很容易的将包涵体蛋白和溶性蛋白分离。这样就减少了分离所须的操作并且增加了纯化产如果所表达的蛋白对于宿主细胞来说是毒性的，那么无活性的包涵会提高细胞存活的可能性，并产生目的蛋白。包涵体蛋白形成后可以直接用显微镜观察到，而不必等到细胞裂解以确定是否表达。
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本文编号：2861054