用人骨髓间充质干细胞筛选人类抗砷相关基因

发布时间：2020-10-29 19:57

　　 目的:长期低剂量亚砷酸钠诱导人骨髓间充质干细胞,从而建立抗砷细胞模型,筛选人类抗砷相关基因。 方法:常规条件下分离培养人骨髓间充质干细胞,检测部分生物学特性;实验组用1μmol/L的亚砷酸钠诱导〉14周,对照组不加砷剂平行培养;48小时急性砷毒性试验检测细胞生存率;免疫荧光染色及荧光激活细胞分选术鉴定诱导前后细胞表面分子;流式细胞术进行细胞周期及凋亡检测;实时定量PCR检测不同诱导时间金属硫蛋白MT1E、多药耐药蛋白基因MRP1、人类抗砷相关基因HARRG的表达丰度;软琼脂试验检测细胞是否发生恶性转化;实验组细胞获得抗砷性之后,抽提并纯化实验组和对照组细胞总RNA,分别与Affymetrix UC133 plus 2.0 cDNA表达谱芯片杂交,生物信息学分析差异表达基因并初步进行功能分类。 结果:低剂量亚砷酸钠急性刺激能够促进人骨髓间充质干细胞增殖,长期诱导则表现为抑制细胞生长;1μmol/L的亚砷酸钠诱导骨髓间充质干细胞10周后细胞初步表现出了抗砷性,14周后抗性较明显。人骨髓间充质干细胞砷诱导后表型无明显变化,而细胞周期的变化较大,急性刺激期G2/M期和S期细胞增加,G0/G1期细胞减少,适应后细胞周期恢复至诱导前水平;长期1μmol/L亚砷酸钠诱导不引起人骨髓间充质干细胞发生凋亡,超过5μmol/L急性刺激则能够诱导其凋亡;人骨髓间充质干细胞砷诱导一定时期内MT1E、MRP1、HARRG表达增高,并呈动态变化趋势;长期砷诱导后人骨髓间充质干细胞在双层软琼脂上不能克隆化生长,没有发生恶性转化。细胞获得抗砷性后与Affymetrix UC133 plus 2.0基因表达谱芯片杂交,筛选出差异表达基因1876条,其中上调表达基因1120条,下调表达基因756条。 结论:长期低剂量砷诱导人骨髓间充质干细胞能够使其产生抗砷性,筛选出差异表达基因1876条。
【学位单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R329
【部分图文】：

d ：CD29 e ：CD90 f：CD166图 1-2 FACS 检测人骨髓间充质干细胞表型（M1 象限为荧光检测阴性区域，M2 象限为荧光检测阳性区域；人骨髓间充质干细胞 CD29、CD90、CD166 表达阳性；CD34、CD45 表达阴性）2.4 人骨髓间充质干细胞周期检测结果培养的第 2 代人骨髓间充质干细胞，细胞周期 82％以上在 G0/G1期，处于 S 期的细胞比例不到 10％，8％左右的细胞处于 G2/M 期；随着传代次数的增多，G0/G1期细胞比例下降，S 期细胞比例增加，G2/M 期细胞比例变化不大，如图 1-3 和表 1-3 所示（不同代次用 passage 表示，简写为 p）。

d ：CD29 e ：CD90 f：CD166图 1-2 FACS 检测人骨髓间充质干细胞表型（M1 象限为荧光检测阴性区域，M2 象限为荧光检测阳性区域；人骨髓间充质干细胞 CD29、CD90、CD166 表达阳性；CD34、CD45 表达阴性）2.4 人骨髓间充质干细胞周期检测结果培养的第 2 代人骨髓间充质干细胞，细胞周期 82％以上在 G0/G1期，处于 S 期的细胞比例不到 10％，8％左右的细胞处于 G2/M 期；随着传代次数的增多，G0/G1期细胞比例下降，S 期细胞比例增加，G2/M 期细胞比例变化不大，如图 1-3 和表 1-3 所示（不同代次用 passage 表示，简写为 p）。

无非特异扩增；标准曲线的相关系数均在 0.95 左右，PCR 的效率>90%，符合 Real-time PCR 相对定量标准。oct-4 在第 3、7、12、18 代人骨髓间充质干细胞中的表达随着自然培养过程中有轻度下降的趋势（表 1-4 和图 1-11）第 7、12、18 代与第3 代分别经配对 t 检验，P 值分别为 0.65、0.27、0.41，无统计学意义。表明普通条件下体外培养的人骨髓间充质干细胞能够保持间充质干细胞的特性，没有在自然培养的过程中发生分化。p3 p7 p12 p181 2 3 4图 1-4 人骨髓间充质干细胞总 RNA 电泳图（泳道 1、2、3、4 分别为第 3、7、12、18 代人骨髓间充质干细胞总 RNA，28s、18s 及 5s 显示清晰，表明总 RNA无降解）
【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 王一;ABCG2与抗砷性产生关系的研究[D];石河子大学;2009年

本文编号：2861377