细菌感染过程中胞外UDP的释放及其功能研究

发布时间：2020-11-01 06:25

　　 固有免疫系统作为宿主第一道防线,对侵入的病原体能够迅速应答,产生非特异抗感染免疫作用。在病原体感染过程中,参与固有免疫的宿主细胞可通过其自身的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),进而诱导炎性细胞因子、Ⅰ型干扰素、趋化因子等发挥天然免疫防御功能,并启动获得性免疫应答。其中研究比较深入的PRRs是膜结合型的Toll样受体(Toll-like receptors.TLRs)。机体在应激或损伤时可同时释放危险相关分子模式(Damage-Associated Molecular Pattern,DAMP),通过激活相应的受体发挥重要的免疫调控作用。其中一类重要的危险信号分子是胞外核苷酸,这类分子能够与其相应的嘌呤类受体相结合而引起下游信号的激活来诱导并调控免疫反应。本实验室前期研究发现,外源性UDP可以诱导体内巨噬细胞释放MCP-1,招募单核细胞进入细菌感染部位,从而发挥抗菌保护作用。但目前对于在细菌感染过程中内源性UDP的来源、释放机制以及其与TLRs的相互调控机制还未见详细报导。本论文以巨噬细胞作为研究对象,通过模拟细菌感染过程,发现TLR信号通路的激活会增加ERK的磷酸化水平,上调Cx43的表达,促进UDP的释放,UDP作用相应的P2Y6受体,引起MCP-1的释放,从而招募更多的单核/巨噬细胞,进而提高机体抵抗细菌的能力。论文包括如下几个方面：1.细菌感染可以诱导细胞释放UDP本论文通过腹腔注射E.coli 0111大肠杆菌的方法建立小鼠腹膜炎感染模型,并通过荧光偏振技术对小鼠腹腔中释放的UDP进行定量检测。结果显示在细菌感染过程中,随着感染时间的延长,小鼠腹腔液中的UDP释放量明显增多,表明细菌感染可以诱导机体释放UDP。同时本文以小鼠巨噬细胞系RAW264.7和骨髓来源巨噬细胞为细胞模型,采用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌模式分子Pam3CSK4和LPS刺激巨噬细胞来模拟细菌感染过程。结果显示,Pam3CSK4和LPS 可以刺激巨噬细胞释放UDP,并呈现出时间和剂量依赖的释放方式。研究结果表明细菌感染与UDP的释放具有相关性,而且UDP的释放过程可能与TLR的激活有一定的联系。2.Connexin43通道介导UDP的释放根据目前的研究报道,胞外核苷酸的释放与通道蛋白、胞吐作用有关,因此,本研究应用膜通道释放抑制剂CBX、FFA以及胞吐抑制剂NEM预处理细胞后,检测这些抑制剂对UDP释放的影响。结果显示,胞吐抑制剂NEM对细胞释放UDP的过程没有影响,而膜通道释放抑制剂CBX和FFA均可以显著抑制LPS诱导的UDP释放,其中Connexin通道抑制剂FFA抑制效果最为明显。进一步采用RT-PCR的方法,显示Connexin43 (Cx43)是巨噬细胞主要表达的连接蛋白,荧光定量PCR以及Western blot方法均证实LPS刺激可以增加Cx43的mRNA和蛋白表达水平。通过Western blot方法检测,发现LPS能够提高ERK、AKT以及P-65的磷酸化水平。分别应用ERK、AKT、P-65磷酸化抑制剂U0126、Ly294002、BAY11后,采用荧光定量PCR的方法,发现U0126能够明显抑制Cx43的表达,而Ly294002和BAY11磷酸化抑制剂没有明显的效果。同时,使用Cx43特异性功能抑制剂Gap26以及ERK磷酸化抑制剂U0126预处理细胞,并通过荧光偏振技术检测UDP含量,发现二者均能降低UDP的释放。结果表明,LPS通过ERK信号通路上调Cx43的表达,并通过Cx43通道的打开释放UDP至细胞外。3.UDP通过P2Y6受体促进MCP-1的释放从而增加机体抗菌能力UDP的特异性受体为嘌呤类受体P2Y6,本文采用UDP特异性受体P2Y6抑制剂MRS2578,并同时构建P2Y6敲除小鼠来检测P2Y6对MCP-1表达的影响。同时应用U0126与Gap26抑制Cx43的表达与功能,结果显示抑制或缺失P2Y6能够降低由LPS引起的MCP-1的表达,抑制Cx43的表达与功能也能够降低LPS诱导的MCP-1的表达。表明LPS引起的UDP释放是通过促进MCP-1的表达,招募更多单核/巨噬细胞,进而增加机体的抗菌能力。在小鼠腹膜炎模型中,细菌感染前先注射UDP特异性受体抑制剂MRS2578以及UDP释放抑制剂FFA、U0126、Gap26,均会降低小鼠体内清除细菌的能力,加速小鼠的死亡。这些结果表明,在细菌感染过程中,释放的UDP对于提高小鼠抵抗细菌感染的能力具有十分重要的作用。综上所述,本研究发现在细菌感染过程中,由于TLR信号通路的激活会引起ERK磷酸化增加,并显著提高Conenxin43的表达上调,进而促进UDP的胞外释放,胞外释放的UDP通过自分泌和旁分泌的方式激活其特异性受体P2Y6,诱导细胞中MCP-1的表达和释放,招募更多单核/巨噬细胞,进而提高机体抗菌能力。本研究从危险信号释放的角度对机体抗菌机制进行深入地研究,明确了胞外UDP及其受体在细菌感染中的重要调控作用,将固有免疫中的病原体模式识别与危险信号模式识别机制有机地联系起来,为深入了解机体的自我免疫调控机制抵抗细菌感染过程奠定了理论基础,也为有关胞外核苷酸的抗菌药物的开发提供了理论依据。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R392
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 TLR的激活引起胞外UDP释放的增加
    一、引言
    二、材料与方法
    三、实验结果
    四、讨论与小结
第二章 细菌感染过程中UDP释放机制的研究
    一、引言
    二、材料与方法
    三、结果
    四、讨论与小结
第三章 胞外UDP释放的抗菌功能研究
    一、引言
    二、材料与方法
    三、结果
    四、讨论与小结
全文总结
附录一
    TABLEⅠ名次缩略
    TABLEⅡ
附录二
参考文献
综述
    参考文献
致谢

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本文编号：2865148