LIM结构域蛋白KyoT2与紧密连接蛋白ZO-2相互作用的验证及相互作用位点的初步确定

发布时间：2020-11-02 17:16

　　 Notch信号转导途径参与细胞命运决定，故此与多种生理及病理过程密切相关。Notch基因广泛表达于胚胎发育过程中的各种组织和各种成熟组织中具有增殖能力的细胞层，该基因编码一个由2753个氨基酸残基的Ⅰ型跨膜蛋白分子受体，其配体也是细胞膜蛋白，称为Delta。当Notch受体受到配体的刺激而激活时，可以传导分化抑制信号。人们将该途径称为Notch途径，Notch途径中最核心的信号分子之一为RBP-J。 RBP-J是果蝇促神经发生基因Su(H)(suppressor of hairless)在哺乳动物的同源物，RBP-J基因敲除小鼠在胚胎第9天死亡，同时伴随一系列异常，包括神经发育过度及体节发育的缺陷，说明RBP-J在哺乳动物胚胎发育中发挥重要作用。 为进一步探讨RBP-J的功能，日本京都大学的Honjo研究组利用酵母双杂交系统筛选到一个可以与RBP-J相互作用的新蛋白KyoT，KyoT蛋白有三种不同的剪切体：KyoT1，KyoT2和KyoT3，其中KyoT2可以与RBP-J相互作用抑制其转录活性。 付包驰 萝 回 旱 匡大纱甩亡学应恃大2咖．53 为深入研究KyoTh在NOtCh－RBPJK途径中的可能作用及其作用机制，本实 验室以 KyOTh为诱饵蛋白通过酵母双杂交得到人类紧密连接蛋白 ZOE。紧密连 接Oigh junchon）又称封闭小带仁onula occludens），主要是存在于脊椎动物上皮 细胞间以及内皮细胞间的连接，其主要功能为封闭相邻细胞间的缝隙，限制一些 大分子在细胞间隙中的自由扩散，同时防止膜蛋白的侧向流动，使膜蛋白定位于 质膜的一定区域，从而维持细胞极性。ZO－2位于紧密连接处的质膜内表面，一方 面与构成紧密连接的跨膜蛋白相互作用，另一方面与细胞骨架发生联系。因此 ZO－2的生物学作用可能参与紧密连接形成和功能调节，经细胞骨架而影响细胞的 形态和运动。 本实验通过酵母双杂交及 GST pull－down as脚验证了 KyO TZ蛋白与 ZOz蛋 白在体外的相互作用，并通过酵母双杂交实验初步确定其相互作用的位点。即 ZO4可以与 KyOTZ的 LM结构域发生特异性的结合，而不与 KyOTh的 LIMI 结构域或 KyOTI的 LIMI及 LIMZ结构域相互作用。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2002
【中图分类】：Q51
【文章目录】：
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文献回顾
    1. 研究蛋白质相互作用的方法
    2. Notch信号途径
    3. LIM结构域蛋白KyoT2
    4. 细胞间连接、紧密连接及紧密连接蛋白
实验材料
    1. 菌种及质粒
    2. 主要试剂
    3. 主要仪器
实验方法
    1. 克隆构建
    2. 序列测定及分析
    3. 蛋白表达纯化
    4. 酵母双杂交
    5. GST pull-down
实验结果
    1. 6号序列的测定
    2. 6号序列的分析结果
    3. KyoT2的原核表达及纯化
    4. 酵母双杂交实验验证KyoT2与ZO-2的相互作用
    5. GST pull-down实验验证KyoT2与ZO-2的相互作用
    6. 酵母双杂交实验验证KyoT2与ZO-2的相互作用位点
讨论
    1. 关于LIM结构域蛋白及KoyT2分子
    2. 关于紧密连接及ZO-2分子
    3. 关于KyoT2与ZO-2的相互作用
小结
致谢
参考文献

【共引文献】

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本文编号：2867332