恶性疟原虫保护性抗原复合基因与人白细胞介素-2基因的重组、表达及其表达产物的鉴定

发布时间：2020-11-03 07:32

　　 疟疾仍然是一种严重危害人类健康的寄生虫病。由于抗药虫株以及媒介按蚊耐药性的不断发生和蔓延，世界疟疾形势日趋恶化，防制难度不断加大。因此，研制高效疟疾疫苗是控制和消灭疟疾的重要途径。虽然疟疾疫苗的研究进展迅速，已由传统的死疫苗和减毒疫苗发展到基因工程疫苗，亚单位疫苗。但迄今为止没有哪一种疫苗能真正有效地控制疟疾的流行与传播。研制多种抗原构成的复合疫苗(又称“鸡尾酒”)疫苗和新型疫苗佐剂是未来疟疾疫苗发展的新策略。 为了进一步提高疟疾疫苗的免疫原性和保护性，本研究将恶性疟原虫保护性抗原复合基因PfCMR与人白细胞介素-2(IL-2)基因在体外重组与高效表达，并对表达产物进行了生物学和免疫学活性鉴定。 用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶酶切质粒pWR450-1／PfCMR，回收255bp目的基因片段PfCMR；用EcoRI消化质粒pBV220／IL-2，并去磷酸化。再将两者按10：1摩尔数混合在连接反应体系中连接。重组克隆用氨苄青霉素初筛，PCR扩增复筛。阳性克隆子再用内切酶进行酶切鉴定。结果得到正向插入的重组质粒pBV220／PfCMR-IL-2a，PfCMR基因与IL-2基因重组克隆获得成功，为恶性疟原虫复合抗原与IL-2的同时表达创造条件。 将重组质粒pBV220／PfCMR-IL-2α转化大肠杆菌DH5α，工程菌经30℃摇菌，42℃热诱导高效表达，用7M盐酸胍破菌，饱和硫酸铵沉淀、分离表达产物。经SDS-PAGE分析证实其分子量为25kDa与理论值相符合，表达产物占菌体总蛋白的37％。表达蛋白的IL-2活性高达5×10~5U／L。
【学位单位】：中山医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：1996
【中图分类】：R383
【文章目录】：
Acknowledgement
Abstract （English）
Abstract （Chinese）
List of Figures/Table/Appendices
Glossary of abbreviations
CHAPTER 1: INTRODUCTION
CHAPTER 2: MATERIAL AND METHODS
    EXPERIMENT NO.1 RECOVERY OF TARGET DNA （PfCMR） FROM PLASMID PWR 450-1/PfCMR
        a. Plasmid PWR450-1 PfCMR DNA extraction. Plasmid isolation:
            Preparation of plasmid DNA
        b. Restriction endonuclease digestion of plasmid DNA（PWR450-1）
        c. Isolation and purification
    EXPERIMENT NO. 2 EXTRACTION OF PLASMID pBV220/IL-2 DNA
        a. DNA extraction
        b. Endonuclease digestion （EcoR1）
    EXPERIMENT NO. 3 LIGATION
        a. Dephosphorylation of linearized plasmid DNA
        b. Ligation of cohesive termini
        c. Ligation of blunt-ended DNA
    EXPERIMENT NO. 4 TRANSFORMATION
        Preparation of competent Escherichia coli cells
        Transformation reaction
    EXPERIMENT NO. 5 CLONING
        a. Screening of bacterial colonies （by PCR）
        b.Analysis and identification of recombinants by restriction endonuclease digestion
    EXPERIMENT NO. 6 EXPRESSION OF pBV220/PfCMR-IL-2/DH5a
    EXPERIMENT NO. 7 ANALYSIS OF THE EXPRESSED PRODUCTS
        Staining SDS-Polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue R250
        Drying SDS-polyacrylamide gels
    EXPERIMENT NO.8 STUDY OF THE BIOLOGICAL AND IMMUNOLOGICAL ACTIVITY OF THE PURIFIED PRODUCTS
        a. Detection of IL-2 by cytotoxic T lymphocyte line （CTLL/MTT）
        b. Humoral immune response
            1. Western blot
                Ⅰ. Transfer of proteins from SDS polyacrylamide gels to solid support
                Ⅱ. Blocking binding sites for immunoglobulins on the nitrocellulose filter
                Ⅲ.Binding of the primary antibody to the target protein
            2. Dot-ELISA
                c. Cellular immune response
CHAPTER.3: RESULTS
    1. Isolation of plasmid DNA
    2. Recovery of target DNA （PfCMR） fragment
    3. Construction of the recombinant vector pBV220/PfCMR-IL-2
        （1） Ligation and transformation
        （2） Transformation
        （3） Screening recombinants by PCR
    4. Identification of positive recombinants by restriction endonuclease digestion
    5. High level expression of pBV220/PfCMR-IL-2
    6. Identification of the expressed protein
        （1） Analysis by Western Blot
        （2） Dot-ELISA Assay
        （3） CTLL/MTT
        （4） T lymphocyte transformation test
FIGURES
CHAPTER 4: DISCUSSION
CHAPTER 5: SUMMARY（English）
SUMMARY（Chinese）
REFERENCES
CHAPTER 6: LITERATURE REVIEW Progress in the development of malaria vaccine
REFERENCES
APPENDICES

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本文编号：2868283