细胞传代对SD大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

发布时间：2020-11-03 09:39

　　 目的探究体外传代培养对SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)衰老的影响。方法全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,待细胞汇合率达80%～90%时,进行消化传代及纯化培养。对不同代数细胞,进行倒置显微镜下观察细胞形态学及生长特性,绘制1～7 d生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原标志物(CD29、CD45和CD90)和细胞周期,β-半乳糖苷酶染色并记录阳性细胞数,Western印迹法检测衰老相关蛋白P53和P21表达情况。结果 SD大鼠BMSCs的CD29、CD90高表达(95%),CD45低表达(5%),细胞周期中G0/G1期占87.37%;相较于P1～5代细胞,P7～9代细胞增殖能力明显下降,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞明显增多;随着传代次数的增加,BMSCs的P53、P21表达增高。结论体外培养传代次数的增加可导致SD大鼠BMSCs衰老。
【部分图文】：

.2BMSCs细胞周期流式细胞仪检测P3BM-SCs细胞周期，细胞100%为二倍体，其中G0/G1期87.37%，G2/M期4.06%，S期8.57%，提示绝大部分细胞处于静止休眠期，符合干细胞周期特征。2.3不同代数细胞生长情况分别对P1、P3、P5、P7和P9代细胞进行1～7d连续培养测定发现，传代后1～2d处于潜伏期，细胞增长不明显，3～5d进入指数増长期，6d后细胞增殖速度便有所减缓，进入平台期，增殖基本停滞，生长曲线见图1。从结果可发现P3～P5代的细胞增殖状况更良好。图1CCK-8检测不同代数BMSCs1～7d的增殖能力2.4不同代数细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率对不同代数的细胞行β-半乳糖苷酶染色，红色箭头标注的着深蓝色的细胞即为衰老细胞(图2)。随之进行β-半乳糖苷酶染色阳性细胞计数，其中P7(52.67%±7.93%)和P9(83.67%±3.27%)相较于P1(3.67%±1.25%)、P3(8.33%±3.11%)和P5(20.00%±5.35%)，SA-β-gal阳性细胞比例明显增高(图2)。2.5不同代数细胞P53和P21表达变化随着传代次数的增加，衰老相关蛋白P53和P21的蛋白水平表达量也逐渐增高，Western印迹结果示:P53和P21在P9代的蛋白相对表达量分别为3.43±0.66和3.31±0.28，明显高于P1代，见图3，表1。图2倒置相差显微镜下观察β-半乳糖苷酶染色阳性细胞(×100)图3细胞传代对衰老相关蛋白P53和P21表达的影响表1不同代数细胞P53和P21表达水平(x±s，n=3)组别P53蛋白P21蛋白P11．00±0.001．00±0.00P31．60±0．111．15±0．07P52．41±0．361．

细上赴?芷谔卣?。2.3不同代数细胞生长情况分别对P1、P3、P5、P7和P9代细胞进行1～7d连续培养测定发现，传代后1～2d处于潜伏期，细胞增长不明显，3～5d进入指数増长期，6d后细胞增殖速度便有所减缓，进入平台期，增殖基本停滞，生长曲线见图1。从结果可发现P3～P5代的细胞增殖状况更良好。图1CCK-8检测不同代数BMSCs1～7d的增殖能力2.4不同代数细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率对不同代数的细胞行β-半乳糖苷酶染色，红色箭头标注的着深蓝色的细胞即为衰老细胞(图2)。随之进行β-半乳糖苷酶染色阳性细胞计数，其中P7(52.67%±7.93%)和P9(83.67%±3.27%)相较于P1(3.67%±1.25%)、P3(8.33%±3.11%)和P5(20.00%±5.35%)，SA-β-gal阳性细胞比例明显增高(图2)。2.5不同代数细胞P53和P21表达变化随着传代次数的增加，衰老相关蛋白P53和P21的蛋白水平表达量也逐渐增高，Western印迹结果示:P53和P21在P9代的蛋白相对表达量分别为3.43±0.66和3.31±0.28，明显高于P1代，见图3，表1。图2倒置相差显微镜下观察β-半乳糖苷酶染色阳性细胞(×100)图3细胞传代对衰老相关蛋白P53和P21表达的影响表1不同代数细胞P53和P21表达水平(x±s，n=3)组别P53蛋白P21蛋白P11．00±0.001．00±0.00P31．60±0．111．15±0．07P52．41±0．361．81±0．18P72．86±0．902．79±0．04P93．43±0．661)3．31±0．281)与P1代比较:1)P＜0．053讨论BMSCs是骨髓基质中的非造血系成体干细胞，具有多向分化潜
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