利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠

发布时间：2020-11-05 21:23

　　 目的利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。
【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 实验动物
    1.2 主要试剂
    1.3 实验方法
        1.3.1 双重sgRNAs设计和转录
        1.3.2 sgRNA体外切割效率
        1.3.3 显微注射及受精卵细胞移植
        1.3.4 敲除小鼠基因型鉴定
        1.3.5 Real time PCR鉴定miR-223在敲除小鼠体内的表达
2 结果
    2.1 双重sgRNAs转录
    2.2 miR-223敲除小鼠基因型鉴定
    2.3 miR-223在敲除小鼠体内表达
3 讨论

【参考文献】

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【共引文献】

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【二级参考文献】

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本文编号：2872206