转hTERT人胚胎神经干细胞系的鉴定及bFGF在人胚胎神经干细胞中的作用

发布时间：2020-11-05 21:30

　　 背景：由于神经干细胞能够自我复制并能产生各种类型的神经细胞，它将在神经系统疾病进行细胞治疗中发挥重要的作用。然而目前神经干细胞在体外的扩增极其有限，这给它在研究和临床应用方面带来极大的不便。通过转端粒酶建立永生神经干细胞系是解决该问题的一个很好的方法，但转端粒酶是否会使神经干细胞发生转化则是人们担心的另一个问题。而bFGF对神经干细胞的增殖和分化有着重要的作用，然而它如何实现这两种不同作用是值得深入去研究的。 目的：鉴定实验室建立的转端粒酶永生化神经干细胞系(HNG和HNG-E)。研究bFGF在神经干细胞中的增殖和分化作用。 方法：通过成瘤实验、流式细胞术分析、Fluo-3钙内流实验、基因芯片、细胞免疫荧光技术、RT-PCR和Western blot等方法对HNG和HNG-E细胞进行鉴定；通过将重组bFGF表达载体(包括pRevTRE／IgK-bFGF和pcDNA3.1(-)／bFGF)转入神经干细胞和HNG-E细胞中，并用细胞免疫荧光技术和Western blot对其进行鉴定。 结果：HNG细胞表达外源端粒酶，同时不具有致瘤性。它为CD90阳性细胞，并能共表达Nestin和GFAP，经RA诱导后可表达MAP2和01(oligophrenin-1)。HNG—E细胞来自早期HNG细胞，具有致瘤性，并失去HNG细胞的原有的表型，但能在RA诱导下表达多巴胺受体2。转入bFGF表达载体到神经干细胞后，细胞没有增殖而发生分化。转入bFGF表达载体到HNG-E细胞建立HNG-E＼bFGF。HNG-E＼bFGF表达外源bFGF，并表达GFAP。 暨南大学硕士学位论文 摘 要 结论：经鉴定，证实HNG细胞为具有神经干细胞表型的永生化细胞系。而HNG－E则为发生 转化的神经干细胞系，但能在RA诱导下向多巴胺能神经元分化。bFGF转入神经干细胞后 能促使其向神经元方向分化。而bFGF对HNG－E细胞具有双向功能，一方面在培养基中加 入bFGF能够促进HNG－E细胞的增殖，另一方面将外源bFGF转入HNG－E细胞中表达又能够 使其表型发生变化具有神经干细胞的表型。
【学位单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：R329
【部分图文】：

图1.端粒结构示意图2.3端粒酶(Telomerase)人端粒酶是一种核糖核蛋白酶，包括了两个主要的亚基:1.RNA组分(hTERC)，它多聚酶反应的模板;2.具有反转录酶活性的催化亚单位(hTERT)。体外实验证实了，存在hTERc和hTERT就足以重建端粒酶的活性。〔41j而许多研究表明外源性hTERT的表足以恢复端粒酶阴性细胞中端粒酶的活性。仁42一44j端粒酶能以自身的RNA为模板，逆转成人类端粒DNA重复序列TTAGGG并添加于染色体3’末端，从而阻止了每次细胞分裂粒序列的丢失，维持了染色体长度的稳定(端粒酶延长端粒见图2)。端粒酶在生物体内的表达受到多种蛋白质反式作用的调控。如p53蛋白可能通过定端粒的T一环上而降低了TERT基因的转录，而HPV16E6的基因产物则能增加该基因的转。〔35，‘5，‘6〕近期的研究发现，端粒酶在体内表达受到C一MYc的直接调控。由于在TERT启动有许多C一MYC结合位点，这些位点与TERT的转录有关。因此CesesMYC所诱导的TERT的表达行TE因。〔州一白相而影响

图2.端粒酶延长端粒示意图端粒长度与细胞衰老和永生化的假说前关于端粒长度与细胞死亡期的关系存在一些假说。〔49j在正常的来自多种组性的非永生化细胞中，存在至少两个端粒依赖的致死期。第一个致死期又称被认为是由于检查点的捕获所致。它可能是通过因关键端粒的缺失或者是一体末端的去帽作用而引起的DNA损伤反应所致。如果细胞缺失这个检查点或长控制突变，细胞就会通过第一死亡期而继续分裂，使端粒DNA不断减少，期(或称危机期)为止。(见图3)危机期的表征是1.主要端粒失去功能2，3.出现细胞凋亡。

图2.端粒酶延长端粒示意图.2.4端粒长度与细胞衰老和永生化的假说目前关于端粒长度与细胞死亡期的关系存在一些假说。〔49j在正常的来自多种组织的酶阴性的非永生化细胞中，存在至少两个端粒依赖的致死期。第一个致死期又称复制老，被认为是由于检查点的捕获所致。它可能是通过因关键端粒的缺失或者是一个或染色体末端的去帽作用而引起的DNA损伤反应所致。如果细胞缺失这个检查点或是发化生长控制突变，细胞就会通过第一死亡期而继续分裂，使端粒DNA不断减少，直至致死期(或称危机期)为止。(见图3)危机期的表征是1.主要端粒失去功能2，遗稳定3.出现细胞凋亡。
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本文编号：2872215