结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

发布时间：2020-11-06 00:59

　　 目的原核表达结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c融合蛋白并进行纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法评价重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,通过重叠PCR扩增得到Rv3425-Rv1168c全核酸序列克隆至表达载体pET-24b中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,通过ELISA检测100份确诊结核病人、20例非结核呼吸疾病患者、100份健康人血清,评价融合蛋白进行临床血清学诊断的可行性。结果 Rv3425-Rv1168c融合蛋白在原核系统内获得高表达,纯化的融合蛋白经ELISA方法测定,在血清学实验中敏感性为54%,特异性为95%。结论 Rv3425-Rv1168c融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫原性,在结核病血清学诊断方面具有很大的应用价值。
【部分图文】：

８ｃ核酸全序列，取少量ＰＣＲ产物进行１％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图１所示，在目的分子量５３０ｂｐ、９７０ｂｐ、１５１８ｂｐ处分别有清晰的Ｒｖ３４２５、Ｒｖ１１６８ｃ以及Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ条带。双酶切重叠ＰＣＲ产物，克隆到载体ｐＥＴ－２４ｂ中，转化至感受态ＢＬ（ＤＥ３）细胞。Ｍ．ＤＬ２０００；１．Ｒｖ３４２５核酸片段；２．Ｒｖ１１６８ｃ核酸片段；３．Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ核酸片段图１Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ核酸序列ＰＣＲ凝胶电泳鉴定结果Ｆｉｇ．１ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆｒａｇ－ｍｅｎｔ２．２Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白原核表达分析将工程菌接种含卡那霉素的ＬＢ培养基中扩大培养，经ＩＰＴＧ诱导后，低温条件下对菌体超声破碎，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果显示（图２），在目的分子量５５ｋＤ处，Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ获得较高表达，但主要以包涵体的形式存在，融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的３０％左右。２．３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白包涵体复性与纯化Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ包涵体经过初步提纯，在８ｍｏｌ／Ｌ尿素与ＰＢＳ缓冲液的变性条件下进行亲和纯化，分别以５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现（如图３

－Ｒｖ１１６８ｃ包涵体经过初步提纯，在８ｍｏｌ／Ｌ尿素与ＰＢＳ缓冲液的变性条件下进行亲和纯化，分别以５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现（如图３所示），纯化后的融合蛋白纯度可达到９０％以上，对纯化的蛋白按１∶１的比例水透析６次后冰Ｍ．低分子量蛋白标准；１．未诱导的全菌体蛋白；２．经ＩＰＴＧ诱导的全菌体蛋白；３．超声上清；４．超声沉淀图２ｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ原核表达产物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ干保存。Ｍ．低分子量蛋白标准；１．上样前；２．５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱峰；３．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱峰图３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白亲和纯化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ２．４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ与ＥＬＩＳＡ分析纯化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后转移至ＰＶＤＦ膜上，分批次经３例强阳性人血清和６例健康人血清孵育、ＨＲＰ标记羊抗人二抗结合反应，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ结果见图４。结果表

１．未诱导的全菌体蛋白；２．经ＩＰＴＧ诱导的全菌体蛋白；３．超声上清；４．超声沉淀图２ｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ原核表达产物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄ－ｕｃｔｓｏｆｐＥＴ－２４ｂ－Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ干保存。Ｍ．低分子量蛋白标准；１．上样前；２．５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱峰；３．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑洗脱峰图３Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白亲和纯化ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅａｆｆｉｎｉｔｙｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ２．４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ与ＥＬＩＳＡ分析纯化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后转移至ＰＶＤＦ膜上，分批次经３例强阳性人血清和６例健康人血清孵育、ＨＲＰ标记羊抗人二抗结合反应，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ结果见图４。结果表明，纯化后的Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ融合蛋白能与３例确诊结核病人血清抗体结合，而与健康人对照血清标本不反应，显示重组融合蛋白具有较强的抗原性和特异性。图４Ｒｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃ与不同人阳性血清ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ结果Ｆｉｇ．４ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆＲｖ３４２５－Ｒｖ１１６８ｃｆｕｓｉｏｎ
【参考文献】

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【共引文献】

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