造血干细胞Hdac3基因促进鼠淋巴细胞分化

发布时间：2020-11-12 00:02

　　 目的建立造血干细胞特异性Hdac3条件性敲除小鼠模型,探讨Hdac3基因对小鼠造血发育的影响。方法 Hdac3~(fl/fl)小鼠与Mx1-Cre小鼠杂交获得Hdac3~(fl/fl)Mx1-Cre小鼠,PCR鉴定小鼠基因型。连续注射poly(I:C),诱导Cre表达,得到造血干细胞Hdac3敲除鼠Hdac3~(fl/fl)Mx1-Cre~+(CKO)及对照组小鼠Hdac3~(+/+)Mx1-Cre~+(WT),Q-PCR分析Hdac3 mRNA表达水平。流式细胞术检测小鼠外周血淋巴细胞数量及比例。HE染色观察小鼠胸腺、脾脏形态学改变。流式细胞术检测小鼠外周血CD3~+、B220~+细胞比例。克隆形成实验分析小鼠造血干/祖(LSK)细胞的分化能力。结果成功建立造血干细胞Hdac3~(fl/fl)Mx1-Cre~+(CKO)小鼠模型。与对照组相比,CKO小鼠外周血淋巴细胞绝对数量(P0.001)及比例(P0.01)均显著降低;细胞亚群分析显示,CKO小鼠外周血CD3~+淋巴细胞及B220~+淋巴细胞显著减少(P0.01,P0.001),CD11b~+髓系细胞比例显著增加(P0.01)。HE染色结果显示,实验组鼠胸腺和脾淋巴细胞数减少。克隆形成实验显示,实验组小鼠粒系克隆数无差异,前B细胞样克隆缺失。结论造血干细胞中Hdac3基因促进造血干细胞向淋巴细胞分化。
【部分图文】：

1-Cre+(CKO)小鼠(图1B)。处死小鼠后，通过TqPCＲ分析WT对照组及CKO小鼠骨髓LSK细胞Hdac3表达。与对照组相比，CKO小鼠Hdac3的mＲNA表达水平显著降低［(1．000±0．203)vs(0．048±0．025)，P＜0．01］。结果显示，成功建立了造血干细胞CKO小鼠模型。A:Hdac3条件性敲除小鼠模型构建示意图;B:poly(I:C)诱导Cre表达示意图;C:小鼠基因型鉴定PCＲ结果左侧图示PCＲ扩增小鼠Hdac3基因，Hdac3fl/fl小鼠产物大小约330bp、Hdac3+/+小鼠产物大小约280bp，小于250bp产物为内参;右侧图示PCＲ扩增小鼠Mx1-Cre基因，产物大小约272bp;M:标准图1成功建立造血干细胞Hdac3-CKO小鼠模型648第三军医大学学报，2019，41(9)http://aammt．tmmu．edu．cn

，两组间血小板、红细胞、血红蛋白数量差异无统计学意义(P＞0．05)，但CKO小鼠外周血白细胞明显低于对照组(P＜0．01)，其中以淋巴细胞数减少为主(P＜0．001)，而中性粒细胞及嗜碱性粒细胞的绝对数差异无统计学意义(P＞0．05，图2A、B)。通过流式细胞术细胞分群显示，CKO小鼠外周血淋巴细胞群比例明显低于对照组［(14．764±3．612)%vs(28．800±2．884)%，P＜0．01，图2C］。为进一步明确Hdac3敲除对小鼠造血发育影响，利用流式细胞术和CD3、B220及CD11b标记，检测小鼠外周血中T细胞、B细胞及粒细胞各群比例，结果显示，与WT组比较，CKO小鼠中T/B淋巴细胞比例显著降低［(28．500±2．179)%vs(16．700±1．836)%，P＜0．01;(29．933±2．610)%vs(10．047±1．631)%，P＜0．001］，粒细胞比例显著升高［(25．567±2．108)%vs(43．533±4．500)%，P＜0．01，图2D～F］。结果显示，CKO小鼠中淋巴细胞发育受阻，但对粒/单核细胞群发育无影响。2．3Hdac3fl/flMx1-Cre+小鼠胸腺及脾淋巴细胞生成障碍为进一步检测Hdac3敲除对小鼠造血系统影响，取小鼠造血器官做组织学形态观察。大体形态学观察显示CKO小鼠胸腺和脾体积明显变小(图3)。HE染色结果显示，CKO小鼠胸腺内淋巴细胞数目显著少于WT鼠(图4A)，CKO小鼠脾内淋巴细胞生发中心数显著少于WT鼠(图4B)。为探究外周血淋巴细胞减少原因，A:CKO及WT小鼠外周血血红蛋白(Hb)、红细胞(ＲBC)、血小板(PLT)绝对计数;B:CKO?

检测了胸腺细胞发育至T细胞各期细胞比例，明确T细胞减少是否由T细胞胸腺内发育阻滞引起。根据胸腺细胞表面CD4、CD8表达，胸腺细胞分为DN(CD4－CD8－)、CD4单阳(SP:CD4+CD8－)、CD8单阳(SP:CD4－CD8+)及DP(CD4+CD8+)期，流式细胞分析结果显示两组间胸腺细胞DN、SP、DP期胸腺细胞比例差异无统计学意义(图4C)。进一步根据CD4－CD8－胸腺细胞表面CD44、CD25的表达，将DN期分为DN1(CD44+CD25－)、DN2(CD44+CD25+)、DN3(CD44－CD25+)和DN4(CD44－CD25－)期，流式细胞分析显示两组间DN1～4期胸腺细胞比例差异无统计学意义(P＞0．05，图4D)。结果显示CKO鼠的胸腺及脾脏发生淋巴细胞生成障碍，其可能是由造血干细胞分化至淋巴祖细胞障碍引起。图3WT及CKO小鼠胸腺、脾脏大体形态A、B:HE染色后光镜下观察WT及CKO小鼠胸腺、脾脏组织形态学变化;C:流式细胞术检测WT及CKO小鼠胸腺细胞CD4及CD8表达情况;右侧柱状图表示DN、CD4单阳、CD8单阳及DP胸腺细胞比例;D:流式细胞术检测WT及CKO小鼠CD4－CD8－胸腺细胞CD44及CD25表达情况;右侧柱状图表示DN1、DN2、DN3及DN4各期胸腺细胞的比例图4Hdac3fl/flMx1-Cre+小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞生成障碍848第三军医大学学报，2019，41(9)http://aammt．tmmu．edu．cn
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