表达趋化因子配体13的重组A组16型柯萨奇病毒的构建

发布时间：2020-11-12 02:25

　　 柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属病毒,是手足口病(Hand,foot and mouse disease,HFMD)的主要病原体之一。CV-A16在世界范围内广泛流行,但目前还没有有效预防CV-A16感染的疫苗上市,CV-A16疫苗的研发仍处于实验室研究阶段。本研究从改善CV-A16诱导体液免疫能力的角度出发,利用反向遗传学手段构建共表达趋化因子配体13的重组A组16型柯萨奇病毒(Coxsackievirus A16-Chemokine(C-X-C motif)ligand 13,CV-A16-CXCL13)。首先利用全基因合成方法设计合成MluⅠ-T7-5'UTR-CXCL13-VP4-VP2-NdeⅠ片段,将该片段插入pCR-XL-TOPO-CV-A16载体中,获得pCR-XL-TOPO-CV-A16-CXCL13克隆载体。将该载体线性化,体外转录出重组病毒RNA并转染细胞,最终获得包装成功的CV-A16-CXCL13重组病毒。使用PCR检测到病毒感染细胞后趋化因子配体13(Chemokine (C-X-C motif) ligand 13,CXCL13)及结构蛋白VP1在基因水平的表达;免疫印记及免疫荧光结果检测到(CXCL13与VP1蛋白水平的表达;电镜结果显示重组病毒为直径20～30nm球状颗粒;增殖曲线显示重组病毒能够在细胞中正常复制。本研究成功构建了CV-A16-CXCL13病毒,为CV-A16感染特征的研究和疫苗研发提供参考。
【文章目录】：
材料与方法
    1 病毒株、细胞株、载体
    2 主要试剂
    3 序列及引物合成
    4 载体的构建
    5 病毒的拯救及鉴定
    6 蛋白印迹实验
    7 免疫荧光实验
    8 透射式电子显微镜
    9 实时逆转录定量PCR
    1 0 病毒TCID50测定
结果
    1pCR-XL-TOPO-CV-A16-CXCL13载体的鉴定
    2 CV-A16-CXCL13病毒的鉴定
    3 CV-A16-CXCL13病毒颗粒的形态观察
    4 CV-A16-CXCL13病毒的增殖动力学分析
讨论

【参考文献】
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本文编号：2880105