PHA基因原核表达载体的构建及功能分析

发布时间：2020-11-15 03:38

　　 为了分析验证phaA、phaB和phaC三个基因的生物学功能，本实验采用PCR技术，从合成PHA的pseudomanas sp．菌株的亚克隆基因组片段中，分离出phaA、phaB和phaC三个基因片段，定向克隆至原核表达载体pBV220上，构建了三个原核生物表达载体pBV-A、pBV-B和pBV-C，通过对表达载体诱导表达，表达蛋白产物的SDS-PAGE分析、生物活性与功能分析，确定了基因phaA、phaB和phaC的生物学功能。结果表明： 1．利用所提取的开放阅读框架的序列设计三对引物，采用PCR技术，从合成PHA的亚克隆片段中分离出phaA、phaB和phaC三个基因片段，经凝胶电泳分析表明，所克隆的三个基因分子量大小与推测的三个开放阅读框架中基因片段大小一致。 2．将phaA、phaB和phaC片段双酶切后，定向克隆至原核表达载体pBV220，构建了三个原核表达载体pBV-A、pBV-B和pBV-C；经酶切分析表明，所克隆的三个基因phaA、phaB和phaC置于表达载体的正确阅读框架下。 3．利用温度诱导外源基因的表达，发现诱导后2小时外源基因开始表达，所表达蛋白的量随着时间的增加而增加，当诱导时间为4小时后外源基因表达的增加量趋于平稳，确定4小时为较为合适的诱导时间。 4．表达载体pBV-A、pBV-B和pBV-C经诱导表达，发现所表达的蛋白均为可溶性蛋白，没有包涵体出现；蛋白经SDS—PAGE分析表明，基因phaA表达的蛋白分子量为42kDa，与β—酮硫裂解酶分子量大小一致；基因phaB表达的蛋白分子量为26kDa，与乙酰乙酰CoA还原酶分子量大小一致；基因phaC表达的蛋白分子量为63kDa，与PHA合成酶分子量大小一致。 5．将phaA、phaB和phaC基因表达的蛋白产物混和后，加入底物乙酰CoA，于230nm—240nm波长下，对反应产物进行扫描，发现在波长235nm处有明显的PHA特异吸收峰；表明混和物中有PHA的产生，所表达的蛋白具有生物学活性和特定功能，证实所克隆的phaA、phaB和phaC就是合成PHA所需的三个基因。
【学位单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2003
【中图分类】：Q785
【部分图文】：

phaA基因的PCR扩增结果因的PCR产物;M:DNA标准分子量PCRamPlifieationofPhaAproduetofPhaA;M:PCRmarker，GC含量为65%，在PCR扩增的过提高扩增的特异性。PCR扩增的循环的三个步骤为:94℃变性1分钟，钟，最后于4℃保温。扩增结果如析表明，所扩增片段的分子量约7B分子量大小一致。

2phaA基因的PCR扩增结果A基因的PCR产物;M:DNA标准分2PCRamPlifieationofPhaA:PCRproduetofPhaA;M:PCRmarbp，GC含量为65%，在PCR扩增数来提高扩增的特异性。PCR扩增循环的三个步骤为:94℃变性110分钟，最后于4℃保温。扩增泳分析表明，所扩增片段的分子phaB分子量大小一致。

.skb，GC含量为66%，AT与GC分，GC同时出现8~IObp以上而没的变性与复性过程中所产生二级温度(62℃)来调整目的基因扩增。PCR扩增的循环程序为:94℃95℃变性1分钟，62℃复性1分钟温。扩增结果如图4所示:PCR扩skb，与所提取的开放阅读框架中
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张云鹏;李志刚;;基于GIS的卫生资源管理平台的开发[J];科技情报开发与经济;2011年19期

2 李石营;于斌;姚登兵;王勇军;张占虎;顾晓松;;坐骨神经缺损后大鼠近端神经新miRNA的鉴定与功能分析[J];中国科学:生命科学;2011年07期

3 郭丹;;基于工作的人力资源管理的局限性及对策[J];河南科技;2011年15期

4 周玉娟;李凯;;基于价值工程的住宅小区智能化系统方案优化[J];甘肃联合大学学报(自然科学版);2011年04期

5 李楠楠;谭亮;王智平;王信超;廖智;;厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3重组表达及黏附功能分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2011年09期

6 王乔;黄飞;陈梅;郭星;;起重机的模块化智能化参数化设计研究[J];科技信息;2011年15期

7 嵇鹏程;魏树伟;;基于CAN总线的井下风机综合保护器的方案研究[J];科技资讯;2011年16期

8 慈凌坤;江力;狄东伟;张军;卢云峰;曹树青;;拟南芥耐硒突变体的筛选和鉴定[J];合肥工业大学学报(自然科学版);2011年06期

9 阎赟梦;李庆华;李杰;柴丹丹;薛乐勋;;杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析[J];郑州大学学报(医学版);2011年04期

10 季焕淑;郭丽;;ASP动态网页数据库访问技术研究[J];科技致富向导;2011年27期

相关博士学位论文 前10条

1 李志勇;调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年

2 萨仁高娃;文昌鱼含有DUF985和Phd-like-VIAF基序的理论蛋白基因的鉴定、表达和功能分析[D];中国海洋大学;2007年

3 葛磊;水稻OsRAA1基因的克隆与功能分析[D];中国科学院研究生院（植物研究所）;2002年

4 范永山;玉米大斑病菌MAPK基因的克隆和功能分析[D];河北农业大学;2004年

5 陈志雄;裸粒水稻花器官变异的形态发生、基因定位及功能研究[D];浙江大学;2005年

6 曹志艳;玉米大斑病菌黑色素合成途径相关基因的克隆及功能分析[D];河北农业大学;2009年

7 聂秀玲;化学诱导启动子的克隆、定点突变及功能分析[D];中国农业大学;2003年

8 赵翔宇;小麦花发育重要基因TaGI1与Ta MADS1的分离与功能分析[D];山东农业大学;2005年

9 吴健敏;中国特有小型猪内源性反转录病毒的检测与全基因克隆[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

10 郝志敏;玉米大斑病菌G蛋白和磷脂酶C基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 丁勇;PHA基因原核表达载体的构建及功能分析[D];安徽农业大学;2003年

2 张立晖;三大新闻次语体的功能分析[D];哈尔滨工程大学;2005年

3 陈新;稻瘟病菌两个漆酶基因功能分析[D];福建农林大学;2008年

4 金雄成;我国信访制度的合理性研究[D];延边大学;2008年

5 张新霞;英国思想库及其功能分析[D];河北师范大学;2004年

6 刘宁;价值工程方法在降低汽车零部件采购成本中的运用[D];吉林大学;2009年

7 方明刚;棉铃虫核多角体病毒的两个保守基因Ha94与Ha132的功能分析[D];中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）;2002年

8 陆竑;客户关系管理在供电企业中的应用研究[D];浙江大学;2005年

9 李瑞锋;价值工程在矿业工程中的应用研究[D];辽宁工程技术大学;2005年

10 林荆;垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SpTPS1）的克隆及其功能分析[D];四川农业大学;2009年

本文编号：2884295