甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

发布时间：2020-11-18 22:22

　　 本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白(NS1)真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒(A/Anhui/3/2013(H7N9))的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。
【部分图文】：

提取质粒。经ＡｓｃⅠ和ＦｓｅⅠ双酶切，进行１％琼脂糖凝胶电泳，获得大小为６５８ｂｐ的目的条带（图３），与预期结果相符，结果表明重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＮＳ１构建成功。２．３ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１酶切鉴定取连接产物ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１５μＬ，采用化学转化法转化Ｔｏｐ１０感受态细胞。挑取单克隆摇菌，提取质粒，然后用ＡｓｃⅠ和ＦｓｅⅠ双酶切，进行１％琼脂糖凝胶电泳，结果显示有大小约６５８ｂｐ目的条带（图４）。将酶切鉴定正确的质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司进行ＤＮＡ测序，测序序列发到ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋ数据库上进行ＢＬＡＳＴ比对分析，结果显示与已发表的ＮＳ１基因序列核苷酸同源性为９９％，氨基酸同源性为９８％。结果表明真核表达载体ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１构建成功。图２重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＮＳ１ＰＣＲ鉴定电泳图注：Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１～４，单克隆；５，阴性对照。图３重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ－ＮＳ１双酶切鉴定电泳图注：１，ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；３，ｐＭＤ１８－Ｔ－ＮＳ１双酶切结果。图４真核表达载体ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１双酶切鉴定电泳图注：Ｍ，ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１，ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１双酶切结果。２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定结果转染ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１的２９３Ｔ细胞表达的重组蛋白可被Ｆｌａｇ抗体识别，其大小

条带（图５），结果表明ＮＳ１在２９３Ｔ细胞中得到表达。图５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１在２９３Ｔ细胞中的表达注：１，ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ－ＮＳ１；２，ｐｃＤＮＡ４－Ｆｌａｇ－ＨＡ空载体。３讨论２０１３年甲型Ｈ７Ｎ９流感病毒被专家确认为全球首发的新亚型流感病毒，因其极易被人忽略的流感症状、高死亡率和快速的传染性，引起高度重视。此次甲型流感致病性和传播速度变化很可能与ＮＳ１蛋白与其宿主相互作用蛋白不同有关，使人们对ＮＳ１蛋白的研究也更加深入。ＮＳ１蛋白只在病毒侵入机体细胞后才生成，暗示ＮＳ１蛋白可能在破坏被感染细胞的过程中扮演着一个关键的角色，对流感病毒的毒性起非常重要的作用。针对目前已报道的甲型Ｈ７Ｎ９流感病毒，用ＤＮＡＭＡＮ软件将其和其他地区的甲型Ｈ７Ｎ９流感病毒ＮＳ１基因核苷酸序列和氨基酸序列进行比对，结果显示２０１３年甲型Ｈ７Ｎ９流感病毒ＮＳ１蛋白与以往流感病毒的ＮＳ１蛋白序列有一定的同源性。甲型流感病毒ＮＳ１蛋白在氨基酸序列上发生变异，影响到流感病毒的致病性及病毒复制效率。近年来，关于ＮＳ１蛋白结构与功能研究结果显示主要功能是结合多种宿主细胞的蛋白。在流感病毒侵染宿主细胞后合成ＮＳ１蛋白，在宿主细胞内合成后，能定位于细胞核内，参与调控宿主细胞的多种免疫反应（Ｍｉｎ等，２００７）。ＮＳｌ蛋白在流感病毒感染的早期细胞内可检测到，而在成熟的病毒粒子里检测不到。ＮＳ１蛋白是一种多功能调节蛋白：①ＮＳ１蛋白抑制宿主细胞蛋白的合成、诱导细胞
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