Jnk2通过smARF的降解来调控压力诱导的线粒体自噬及组织损伤

发布时间：2017-04-06 15:02

  本文关键词：Jnk2通过smARF的降解来调控压力诱导的线粒体自噬及组织损伤，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：自噬是一个自我清理的过程,通过细胞质蛋白质和细胞器被隔离在一个双层膜自噬体中,然后它通过与溶酶体融合形成自噬溶酶体来降解细胞质蛋白,大分子和细胞器,从而实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。我们将细胞通过自噬机制清除受损或不需要的线粒体的途径称为线粒体自噬,这里我们将研究重点放在线粒体自噬上。线粒体自噬是一个特异性的选择过程,并受到各种因子的精密调节,对维持细胞的动态平衡是至关重要的,但是其详细的调控机制在很大程度上是未知的。线粒体自噬的异常调控已经涉及到许多疾病和病理生理活动。众多研究表明JNK信号通路在人类疾病中发挥十分重要和复杂的作用。它在细胞周期、生殖、凋亡和细胞应激等多种生理过程中也起到了很重要的作用。JNK是c-Jun氨基末端激酶又称应激活化蛋白激酶,JNK蛋白激酶由三个基因编码,JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2基因在全身广泛表达,而JNK3呈限制性表达。我们的研究表明,在细胞压力或外界条件刺激下,JNK2通过调节sm ARF蛋白的表达诱导了细胞线粒体自噬。sm ARF是在线粒体上特异性表达的肿瘤抑制蛋白ARF的亚型形式,也可以说是在线粒体上特异性表达的肿瘤抑制蛋白ARF的可变剪切亚型。有研究表明通过外源过度表达sm ARF蛋白水平能诱导线粒体的去极化和随后的线粒体自噬。在这篇文章中,我们发现JNK2能促进sm ARF蛋白的泛素化,导致了内源sm ARF蛋白通过蛋白酶体途径降解。在JNK2缺陷型细胞中,sm ARF蛋白的失调导致了其在细胞中过多的积累,从而抑制了压力诱导的线粒体自噬活性,使受损的线粒体不能通过线粒体自噬被清除,进而积累了过多的线粒体活性氧(ROS)。有文章报道表明线粒体自噬缺陷能够产生过多的活性氧(ROS),而过多的活性氧(ROS)可以导致炎症的过度活化。在这篇文章中我们又发现,在缺氧压力下,JNK2基因缺陷的小鼠显示有缺陷的线粒体自噬,导致组织损伤。我们的研究发现能一种新颖的维持免疫稳态机制,通过这种机制进而保护组织的损伤,这为更进一步了解一些疾病的治疗策略提供了一定的参考价值。
【关键词】：线粒体自噬 JNK2 smARF 组织损伤 泛素化
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 1 研究背景8-13
• 1.1 线粒体自噬8-9
• 1.1.1 细胞自噬和线粒体自噬8-9
• 1.1.2 线粒体自噬的机制9
• 1.2 JNK信号通路9-10
• 1.3 smARF和泛素蛋白酶体途径10-11
• 1.3.1 smARF10-11
• 1.3.2 泛素蛋白酶体途径11
• 1.4 研究目的和意义11-13
• 2 实验材料13-15
• 2.1 细胞系13
• 2.2 质粒和细菌13
• 2.3 siRNA的合成和序列13-14
• 2.4 实验试剂14
• 2.5 抗体信息14
• 2.6 小鼠14-15
• 3 实验方法15-29
• 3.1 质粒和siRNA的转染（6 孔板）15
• 3.2 Western blot15-17
• 3.2.1 细胞中的蛋白样品 (以六孔板为例)15-16
• 3.2.2 组织中的蛋白样品16
• 3.2.3 制胶和电泳16
• 3.2.4 转膜和封闭16-17
• 3.2.5 抗体孵育和显影17
• 3.3 免疫共沉淀CO-IP17-19
• 3.3.1 铺板17
• 3.3.2 准备beads17-18
• 3.3.3 样品抗体共孵育18
• 3.3.4 CO-IP样品的制备18
• 3.3.5 蛋白检测18-19
• 3.4 泛素化实验19
• 3.5 细胞质和细胞核的抽提19-20
• 3.5.1 样品的制备19-20
• 3.5.2 细胞质与细胞核的抽提20
• 3.6 线粒体/细胞质的分离抽提20-22
• 3.6.1 实验准备21
• 3.6.2 细胞抽提21-22
• 3.7 转化22
• 3.8 质粒DNA提取22-26
• 3.8.1 少量质粒DNA的抽提22-23
• 3.8.2 大量质粒DNA的提取23-26
• 3.9 线粒体活性氧（ROS）的测量26
• 3.10 荧光显微镜(Fluorescence microscopy)26-27
• 3.11 体内实验27
• 3.12 稳定细胞系的构建27-29
• 4 结果29-44
• 4.1 JNK2 对压力诱导的线粒体自噬是必要的29-31
• 4.2 JNK2 能不依赖于PINK1/Parkin途径正调节线粒体自噬31-33
• 4.3 JNK2 的缺失能稳定smARF蛋白33-35
• 4.4 JNK2 能促进smARF蛋白的泛素化和降解35-38
• 4.5 JNK2 能减缓缺氧诱导的组织损伤38-41
• 补充数据41-44
• 5 讨论44-46
• 6 结论46-47
• 参考文献47-51
• 攻读学位期间的研究成果51-52
• 致谢52-53

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