铜绿假单胞菌基因PA4591及操纵子PA4591-PA4594的功能研究

发布时间：2017-04-06 18:19

  本文关键词：铜绿假单胞菌基因PA4591及操纵子PA4591-PA4594的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：铜绿假单胞菌是一类重要的革兰氏阴性机会致病菌,是导致院内感染的主要病原微生物。该病原菌是免疫缺陷患者(如HIV患者、肺囊肿纤维化病人、烧伤患者等)发生高发病率和高死亡率的主要原因。然而由于其自身所具备的极强的内在抗药性和获得性耐药,使得医院对感染了铜绿假单胞菌的病人的治疗过程变得非常困难。因此在优化临床用药和采用新型杀菌剂的治疗中必须首先弄清楚铜绿假单胞菌耐药性产生的原因和致病机理,从基因水平进行深入研究。实验室前期通过利用碳青霉烯类中的三种代表性的抗生素(美罗培南、亚胺培南和比亚培南)对包含3万多株转座子随机标记的铜绿假单胞菌突变体库进行筛选,得到了多个与碳青霉烯类敏感与耐药相关基因。其中的一株转座突变体PA4591对碳青霉烯类的抗性增加了四倍。本课题关注该基因PA4591及该基因所组成的ABC转运子产生耐药的原因和基因功能,并做了一系列的研究。实验中发现在突变体PAO1(△4591)中,药物外排泵mexAB-oprM的表达是野生型中的两倍多,mexAB-oprM表达的增加有可能是PAO1(△4591)对碳青霉烯类抗生素耐受性增高的重要原因。突变体PAO1(△4591)中,PQS的产量明显降低。实验还发现绿脓菌素的量和突变体PAO1(△4591)水解蛋白的能力也明显减少。而在铜绿假单胞菌中,蛋白水解酶和绿脓菌素是两类重要的毒力因子。实验通过果蝇喂食感染模型和白菜模型证实突变体PAO1(△4591)的致病性降低。PA4591在维持铜绿假单胞菌的致病能力方面也有着不可或缺的作用。对PA4591的基因编码产物进行分析预测,发现该蛋白属于HlyD家族分泌蛋白,而且该基因与PA4592、PA4593和PA4594共同构成一个ABC转运子,其表达的蛋白产物涉及到对溶血素的转运过程。溶血素作为一类重要的毒力因子,尚未在铜绿假单胞菌中的报道中发现对其转运机制的研究。研究中发现突变体PAO1(△4591)、PAO1(△4592)和PAO1(△4593)使铜绿假单胞菌丧失溶血能力,证明该ABC转运子对于铜绿假单胞菌溶血素的转运过程具有至关重要的作用。然而,PA4594的突变体PAO1(△4594)仍然具有溶血活性。这并非说明溶血素的转运不需要能量,有可能也存在其它形式的能量为铜绿假单胞菌溶血素的转运提供动力,铜绿假单胞菌溶血素转运过程中能量的供应来源仍有待进一步细致的研究。此外,实验还对各突变体PAO1(△4592)、PAO1(△4593)和PAO1(△4594)的碳青霉烯类抗生素的敏感程度进行了测定,发现PAO1(△4592)、PAO1(△4593)对碳青霉烯类抗生素表现出明显的耐受性,而PAO1(△4594)的耐药表型与野生型PA01一致,由此也说明溶血素的转运过程与铜绿假单胞菌的耐药性紧密关联。该ABC转运子对铜绿假单胞菌的生理生化功能有重要影响。
【关键词】：ABC转运子 耐药性 铜绿假单胞菌 致病性 碳青霉烯类抗生素
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-12
• 缩略语比对表12-13
• 第一部分 引言13-23
• 1.1 铜绿假单胞菌的耐药性13
• 1.2 碳青霉烯类抗生素13-14
• 1.3 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究进展14-16
• 1.4 铜绿假单胞菌的致病性16-18
• 1.5 细菌中的ABC转运系统18-21
• 1.5.1 ABC转运子的结构19-20
• 1.5.2 ABC转运子的转运机制20
• 1.5.3 ABC转运子在微生物耐药性与致病性方面的研究20-21
• 1.6 研究内容及意义21-23
• 第二部分 材料和方法23-37
• 2.1 实验材料23-27
• 2.1.1 质粒、菌株和引物23-25
• 2.1.2 培养基和缓冲液25-26
• 2.1.3 试剂26-27
• 2.1.4 仪器27
• 2.2 实验方法27-37
• 2.2.1 铜绿假单胞菌感受态细胞的制备27-28
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备28
• 2.2.3 质粒提取28-29
• 2.2.4 琼脂糖凝胶核酸片段回收纯化29
• 2.2.5 酶切与连接29
• 2.2.6 电转化29-30
• 2.2.7 构建敲除突变体30-32
• 2.2.8 基因敲除突变体的互补32-33
• 2.2.9 抗生素敏感性的检测33
• 2.2.10 抗生素最低抑制浓度(MIC)的检测33-34
• 2.2.11 外排泵表达水平的测定34
• 2.2.12 溶血能力的测定测定34
• 2.2.13 PQS的提取及薄层层析34-35
• 2.2.14 绿脓菌素的测定35
• 2.2.15 蛋白水解酶活性检测35
• 2.2.16 果蝇模型检测致病性35-36
• 2.2.17 白菜模型检测致病性36-37
• 第三部分 结果37-51
• 3.1 PA4591基因功能的研究37-45
• 3.1.1 基因PA4591的相关信息37
• 3.1.2 基因PA4591的敲除与互补37-39
• 3.1.3 基因PA4591涉及到对碳青霉烯类抗生素的敏感性39-40
• 3.1.4 突变体中mexAB外排泵表达增加40
• 3.1.5 双突变体PAO1(△4591△mexAB)的构建40-41
• 3.1.6 PAO1(△4591)丧失溶血能力41-42
• 3.1.7 PAO1(△4591)中PQS产量明显降低42-43
• 3.1.8 PA4591突变影响绿脓菌素的合成43-44
• 3.1.9 PA4591突变影响蛋白水解酶活性44
• 3.1.10 PAO1(△4591)降低铜绿假单胞菌的致病能力44-45
• 3.2 ABC转运子PA4591-PA4594功能的初步探索45-51
• 3.2.1 操纵子PA4591-PA4594的生物信息学分析46-48
• 3.2.2 基因PA4592、PA4593和PA4594敲除突变体的构建48-49
• 3.2.3 PAO1(△4592)、PA01(△4593)和PAO1(△4594)溶血能力的检测49-50
• 3.2.4 PAO1(△4592)、PA01(△4593)和PAO1(△4594)抗生素敏感性的变化50-51
• 第四部分 总结与讨论51-54
• 参考文献54-62
• 攻读硕士学位期间取得的成果62-63
• 致谢63

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1 王波波;铜绿假单胞菌基因PA4591及操纵子PA4591-PA4594的功能研究[D];西北大学;2015年

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