肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ相互作用研究

发布时间：2017-04-07 06:53

  本文关键词：肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ相互作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：明确肺炎链球菌糖酵解关键酶烯醇化酶(enolase, Eno)与热休克蛋白DnaJ是否有直接结合及结合位点,初步探讨DnaJ蛋白对Eno蛋白胞内蛋白水平及胞外分泌的影响。方法：原核表达并纯化Eno全长蛋白,鉴定其酶活性,利用重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制备特异性抗血清,分析其蛋白表达及胞外分泌情况；采用生物膜层干涉(biolayer interferometrvy, BLI)技术和直接结合实验鉴定Eno和DnaJ两者之间是否存在直接相互作用；在前者结果阳性的基础上,截短表达Eno蛋白,通过直接结合实验鉴定Eno蛋白结合DnaJ的位点。根据结合位点结果,构建一系列异位表达的重组pJWv25-eno截短片段,转化肺炎链球菌R6菌株,Western blot检测各片段的胞内及胞外蛋白水平,分析DnaJ的结合对Eno蛋白水平的影响。在肺炎链球菌中过表达DnaJ蛋白,通过Western blot检测Eno蛋白的胞内及胞外蛋白水平,进一步鉴定DnaJ对Eno蛋白胞内蛋白水平及分泌的影响。结果：成功表达重组Eno蛋白,纯度达90%,该蛋白具有a-Eno酶活性；重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后,获得效价达1：7.68×106的特异性抗血清；Western blot分析显示,7种不同血清型肺炎链球菌培养上清中均在分子量约47 kD处出现特异性反应带；直接结合试验显示,随着Eno蛋白量的增加,Eno与DnaJ的结合量也相应增加(r=0.920,P=0.000),其吸光度值从0.222±0.042(1.25μg)增加到0.569±0.099(20.0 μg)；BLI技术测定两者结合的亲和常数为926nmol/L;截短的Eno(aa1-aa100)与DnaJ的结合量2.25±0.38高于其他截短序列的结合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12,差异具有统计学意义(P=0.000,P=0.001,P=0.000)。Western blot结果显示,各截短片段均能在肺炎链球菌胞内表达,仅片段Eno3及Eno4可在培养上清中被检测；过表达DnaJ情况下,肺炎链球菌中胞内的Eno蛋白水平无明显变化,培养上清中的Eno蛋白量减少。结论：肺炎链球菌Eno蛋白与DnaJ蛋白存在直接结合作用,结合位点主要位于其N端的1-100个氨基酸序列。DnaJ蛋白与Eno蛋白的结合能力强弱与Eno蛋白的分泌能力无关,但DnaJ过表达可降低Eno蛋白的胞外分泌水平。
【关键词】：肺炎链球菌 烯醇化酶 DnaJ 蛋白相互作用
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.14
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ结合及结合位点鉴定14-30
• 1 材料与方法14-20
• 2 结果20-27
• 3 讨论27-30
• 第二部分 肺炎链球菌热休克蛋白DnaJ对烯醇化酶胞内蛋白量及胞外分泌的影响30-37
• 1 材料与方法30-32
• 2 结果32-35
• 3 讨论35-37
• 全文总结37-38
• 参考文献38-41
• 文献综述41-49
• 参考文献45-49
• 致谢49-50
• 攻读学位期间发表的学术论文50

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 高强,李庆,贺靖冬;32株肺炎链球菌的分离和药敏分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2001年S1期

2 ;美国科学家绘制出肺炎链球菌基因全图[J];现代临床医学生物工程学杂志;2001年05期

3 熊桃菊;肺炎链球菌I型致成人脑膜炎1例[J];临床检验杂志;2002年03期

4 胡晓彦;桂炳东;;肺炎链球菌分子流行病学研究进展[J];江西医学检验;2007年05期

5 吴金珊;李佳;王晓鹏;;肺炎链球菌对大环内酯类抗生素耐药的研究进展[J];中国实用医药;2010年12期

6 ;肺炎链球菌对临床干预演变快[J];透析与人工器官;2010年03期

7 王东霞;惠小夏;;肺炎链球菌的检验技术及其进展探讨[J];内蒙古中医药;2011年12期

8 杨锦红;刘洋;王新林;李方去;陶洪群;李向阳;;肺炎链球菌的扩增片段长度多态性快速检测方法的建立和应用[J];医学研究杂志;2012年06期

9 李洁,俞桑洁,杨永弘;肺炎链球菌疾病及其预防[J];中国计划免疫;1999年03期

10 陆德源;;肺炎链球菌表面蛋白A是肺炎链球菌的一种乳铁蛋白结合蛋白[J];国外医学(微生物学分册);2000年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周忠华;刘华;喻华;;69株肺炎链球菌的体外抗菌药物活性研究[A];中华医院管理学会第十一届全国医院感染管理学术年会论文汇编[C];2004年

2 唐恒;陈勃江;李为民;;219株呼吸道肺炎链球菌的分离及耐药性分析[A];中华医学会第12次全国内科学术会议论文汇编[C];2009年

3 张媛媛;王一雯;孙胜利;贺建平;;耐青霉素性肺炎链球菌致急性化脓性脑膜炎1例[A];第九届西北五省（区）检验医学学术会议论文汇编[C];2005年

4 吴佳学;季海生;朱德全;;儿科痰培养肺炎链球菌耐药分析对临床的指导作用[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

5 黄小翠;崔亚利;;儿童使用的肺炎链球菌疫苗研究进展[A];第一次全国中西医结合检验医学学术会议暨中国中西医结合学会检验医学专业委员会成立大会论文汇编[C];2014年

6 胡惠丽;胡翼云;何乐健;沈叙庄;高薇;杨永弘;;肺炎链球菌在儿童社区获得性肺炎死亡病例中致病地位的研究[A];中华医学会第十四次全国儿科学术会议论文汇编[C];2006年

7 胡庆丰;吕火祥;沃铭毅;;53例呼吸道分离的肺炎链球菌耐药性分析[A];2007年浙江省医学检验学学术年会论文汇编[C];2007年

8 高薇;姚开虎;俞桑洁;杨永弘;;2000～2005年分离自北京儿童鼻咽部的19群肺炎链球菌的耐药性变化[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编（上册）[C];2008年

9 余素飞;厉世笑;傅鹰;陈慧红;朱海燕;陈文娴;张慧娜;;肺炎链球菌对大环内酯类的耐药机制研究[A];2011年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2011年

10 黄勇;万根平;顾晓琼;邓秋连;梁柳;钟华敏;;广州地区儿童感染肺炎链球菌耐药相关基因的研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 北京儿童医院微生物免疫室 姚开虎;接种哪种肺炎链球菌疫苗好[N];健康报;2007年

2 邓力;肺炎链球菌易攻击小孩和老人[N];健康报;2007年

3 记者 王丹;儿童肺炎链球菌性疾病防治指南发布[N];健康报;2010年

4 周密;山羊可能感染了肺炎链球菌病[N];江苏农业科技报;2010年

5 记者 吴伟农;美科学家绘制出肺炎链球菌基因图谱[N];新华每日电讯;2001年

6 本报记者 李颖;肺炎链球菌遇流感病毒危害更大[N];科技日报;2010年

7 卫生部北京医院 张秀珍;肺炎链球菌对青霉素耐药率上升快[N];健康报;2008年

8 中华医学会公共卫生学分会主任委员 曾光;秋冬季请呵护好“呼吸大道”[N];健康报;2010年

9 记者 毛黎;遨游天宇的特殊客[N];科技日报;2007年

10 记者 郑灵巧;流感继发肺炎链球菌疾病危害大[N];健康报;2010年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李琼;肺炎链球菌自溶素LytA的结构和功能研究[D];中国科学技术大学;2015年

2 陈蓉;儿童呼吸道感染病原学及肺炎链球菌耐药的分子流行病学研究[D];复旦大学;2010年

3 张巧;肺炎链球菌毒力蛋白基因工程疫苗的实验研究[D];第三军医大学;2010年

4 孟江萍;应用启动子诱捕策略筛选并初步鉴定肺炎链球菌宿主体内诱导基因[D];重庆医科大学;2005年

5 张雪梅;肺炎链球菌转化对细菌毒力和耐药性影响的研究[D];重庆医科大学;2003年

6 马千里;肺炎链球菌毒力蛋白基因工程疫苗优势抗原筛选[D];第三军医大学;2009年

7 贲亚t ;肺炎链球菌HMG-CoA合成酶和还原酶基因克隆表达及功能研究[D];华中师范大学;2008年

8 牛司强;一种肺炎链球菌溶菌酶样假想蛋白质SP0987的结构和功能研究[D];重庆医科大学;2011年

9 李南;肺炎链球菌组氨酸激酶（VicK）的同源模建及其先导抑制剂的筛选和鉴定[D];重庆医科大学;2009年

10 胥文春;DFI体内筛选肺炎链球菌致脑膜炎相关基因[D];重庆医科大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 耿倩;苏州地区呼吸道感染儿童肺炎链球菌携带率、耐药现状和分子流行病学研究[D];复旦大学;2014年

2 许佳毅;大环内酯类（阿奇霉素）对肺炎链球菌小鼠模型的疗效研究[D];复旦大学;2014年

3 刘学欣;肺炎链球菌临床分离株耐药机制和常见血清型及毒力基因研究[D];天津医科大学;2015年

4 崔建邦;重庆地区儿童急性呼吸道感染肺炎链球菌耐药性及耐药基因的研究[D];重庆医科大学;2015年

5 王建敏;肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ相互作用研究[D];重庆医科大学;2015年

6 李马超;肺炎链球菌分子分型与耐药性研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年

7 高华;肺炎链球菌生物学特性鉴定及耐药性分析[D];北京生物制品研究所;2004年

8 吴艳丽;肺炎链球菌表面粘附素A的原核表达和免疫保护性的初步研究[D];大连医科大学;2009年

9 姚成;肺炎链球菌耐药性、分子流行病学和耐药机制[D];重庆医科大学;2002年

10 秦燕;抗肺炎链球菌工程多肽体内外抗菌活性研究[D];四川大学;2006年

  本文关键词：肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ相互作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：289815