混合血小板裂解液对人骨髓间充质干细胞原代培养、增殖和成骨分化的影响
发布时间：2020-12-08 14:12
目的研究混合血小板裂解液(pHPL)对体外培养的人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)原代培养、增殖和成骨分化的影响。方法使用临床过期的多份浓缩血小板混合,多次冻融激活后制备pHPL,分别使用胎牛血清(FBS)和pHPL加基础培养液原代培养hBMMSCs,比较两组中的细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期和增殖率,并在加入经典成骨诱导液后检测两组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量和矿化结节形成,比较其成骨分化能力。结果 FBS和pHPL培养组均能较好地支持hBMMSCs的原代培养,两组中细胞形态、表面标志物、细胞骨架、细胞周期均无明显差异,但pHPL组在5、7 d时的细胞增殖率明显高于FBS组(P<0.05);在成骨诱导后,pHPL组中碱性磷酸酶含量、成骨相关基因含量也明显高于FBS组(P<0.05),两组中细胞均可以形成成熟的矿化结节。结论 pHPL能够很好支持hBMMSCs的原代培养、增殖和成骨分化,且较FBS能更好地促进其增殖和成骨分化。
【文章来源】：中国当代医药. 2019年18期 第13-18页
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图1两组第二代细胞培养7d（100×）
状物质。8~10d左右A组和B组均出现细胞聚集形成的致密细胞结节，结节中心致密，透光性差，而周围细胞呈放射状分布，随培养时间延长细胞结节的数量逐渐增加。AB图1两组第二代细胞培养7d（100×）2.2两组hBMMSCs表面标志物检测情况的比较流式细胞仪检测结果显示，所获得的hBMMSCs纯度较高，细胞一致性好。其中CD29、CD44、CD105的表达均为阳性，而CD14、CD90均为阴性表达，两组间表面标志物检测无明显差异（图2）。2.3两组细胞骨架免疫荧光染色情况的比较免疫荧光染色显示，两组hBMMSCs均具有良好的微管微丝系统（图3），提示两种培养条件下细胞均可以正常生长且具有良好功能。ImageJ软件测量A组细胞长宽比为2.17±0.65，B组为2.30±0.58，两组比较差异无统计学意义（t=0.575，P=0.572）。RUNX2ALPCOL-IOCGAPDHForward:5′-TCCAACCCACGAATGCACTA-3′Reverse:5′-GAAGGGTCCACTCTGGCTTTG-3′Forward:5′-GTCACTGCGGACCATTCC-3′Reverse:5′-GGCTGCATACGCCATCAC-3′Forward:5′-AGGTGTTGTGCGATGACG-3′Reverse:5′-CTCATCATAGCCATAAGAC-3′Forward:5′-CAGCCACCGAGACACCATG-3′Reverse:5′-CAGAGCGACACCCTAGACC-3′Forward:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′Reverse:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′基因引物序列图2hBMMSCs的表面标志物AB15
·论著·中国当代医药2019年6月第26卷第18期CHINAMODERNMEDICINEVol.26No.18June2019AB图3两组中hBMMSCs的细胞骨架（200×）2.4两组细胞周期的比较A、B两组中hBMMSCs均有90%左右处于G0/G1期，显示大部分细胞均处于静止期，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。图4两组中hBMMSCs的细胞周期2.5两组细胞增殖率的比较两组中hBMMSCs均可以快速增殖，并在约5~7d时进入平台期。B组在5、7d时的细胞增殖率高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。提示pHPL促进hBMMSCs增殖的效果较FBS更强。表2两组细胞增殖率的比较（OD值，x±s）2.6两组ALP水平的比较加入成骨诱导液后，两组中ALP含量均逐渐上升，并在第10天左右达到高峰，但B组中ALP含量在2、6、10、14d时均高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。表3两组ALP水平的比较（mmol/L，x±s）2.7两组成骨相关基因检测情况的比较经实时定量PCR检测，将A组的数据作为1，测得B组的平均相对含量，结果显示，B组中成骨相关基因RUNX2、ALP、COLI、OC表达水平均高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。表4荧光定量PCR结果（2-△△Ct）2.8两组的矿化结节茜素红染色情况两组细胞在成骨诱导培养14d后均可见到染色的成熟矿化结节形成（图5）。图5两组中矿化结节茜素红染色（100×）3讨论间充质干细胞（humanmesenchymalstemcells，hM-SCs）具有良好的体外扩增能力和多向分化潜能，是最有希望应用于临床干细胞治疗的成体干细胞，也是组织工程研究中最有前景的种子细胞之一[3]，骨髓来源的hBMMSCs则是相对最容易获得的hMSCs[4]。但成人组织中干细胞数量极其有限，为了获得足够用于临床应用的细胞量，需要对其进行体外扩增，多数情况下?
本文编号：2905220
【文章来源】：中国当代医药. 2019年18期 第13-18页
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图1两组第二代细胞培养7d（100×）
状物质。8~10d左右A组和B组均出现细胞聚集形成的致密细胞结节，结节中心致密，透光性差，而周围细胞呈放射状分布，随培养时间延长细胞结节的数量逐渐增加。AB图1两组第二代细胞培养7d（100×）2.2两组hBMMSCs表面标志物检测情况的比较流式细胞仪检测结果显示，所获得的hBMMSCs纯度较高，细胞一致性好。其中CD29、CD44、CD105的表达均为阳性，而CD14、CD90均为阴性表达，两组间表面标志物检测无明显差异（图2）。2.3两组细胞骨架免疫荧光染色情况的比较免疫荧光染色显示，两组hBMMSCs均具有良好的微管微丝系统（图3），提示两种培养条件下细胞均可以正常生长且具有良好功能。ImageJ软件测量A组细胞长宽比为2.17±0.65，B组为2.30±0.58，两组比较差异无统计学意义（t=0.575，P=0.572）。RUNX2ALPCOL-IOCGAPDHForward:5′-TCCAACCCACGAATGCACTA-3′Reverse:5′-GAAGGGTCCACTCTGGCTTTG-3′Forward:5′-GTCACTGCGGACCATTCC-3′Reverse:5′-GGCTGCATACGCCATCAC-3′Forward:5′-AGGTGTTGTGCGATGACG-3′Reverse:5′-CTCATCATAGCCATAAGAC-3′Forward:5′-CAGCCACCGAGACACCATG-3′Reverse:5′-CAGAGCGACACCCTAGACC-3′Forward:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′Reverse:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′基因引物序列图2hBMMSCs的表面标志物AB15
·论著·中国当代医药2019年6月第26卷第18期CHINAMODERNMEDICINEVol.26No.18June2019AB图3两组中hBMMSCs的细胞骨架（200×）2.4两组细胞周期的比较A、B两组中hBMMSCs均有90%左右处于G0/G1期，显示大部分细胞均处于静止期，两组比较差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。图4两组中hBMMSCs的细胞周期2.5两组细胞增殖率的比较两组中hBMMSCs均可以快速增殖，并在约5~7d时进入平台期。B组在5、7d时的细胞增殖率高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。提示pHPL促进hBMMSCs增殖的效果较FBS更强。表2两组细胞增殖率的比较（OD值，x±s）2.6两组ALP水平的比较加入成骨诱导液后，两组中ALP含量均逐渐上升，并在第10天左右达到高峰，但B组中ALP含量在2、6、10、14d时均高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。表3两组ALP水平的比较（mmol/L，x±s）2.7两组成骨相关基因检测情况的比较经实时定量PCR检测，将A组的数据作为1，测得B组的平均相对含量，结果显示，B组中成骨相关基因RUNX2、ALP、COLI、OC表达水平均高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。表4荧光定量PCR结果（2-△△Ct）2.8两组的矿化结节茜素红染色情况两组细胞在成骨诱导培养14d后均可见到染色的成熟矿化结节形成（图5）。图5两组中矿化结节茜素红染色（100×）3讨论间充质干细胞（humanmesenchymalstemcells，hM-SCs）具有良好的体外扩增能力和多向分化潜能，是最有希望应用于临床干细胞治疗的成体干细胞，也是组织工程研究中最有前景的种子细胞之一[3]，骨髓来源的hBMMSCs则是相对最容易获得的hMSCs[4]。但成人组织中干细胞数量极其有限，为了获得足够用于临床应用的细胞量，需要对其进行体外扩增，多数情况下?
本文编号：2905220
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/binglixuelunwen/2905220.html
最近更新
教材专著
