人包皮成纤维细胞酵母双杂交均一化cDNA文库的构建
发布时间：2020-12-09 17:23
目的构建人包皮成纤维细胞（HFF）酵母双杂交均一化cDNA文库,为研究弓形虫与宿主细胞间的相互作用及其入侵机制奠定基础。方法复苏、培养HFF细胞并提取细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成ds cDNA,对其进行均一化处理后,利用SfiI酶切,酶切后的ds cDNA连接pGADT7-SfiI三阅读框表达载体,连接产物转化至大肠埃希菌HST08,构建cDNA初级文库,进行库容检测和插入片段的PCR鉴定。提取文库质粒转化至酵母Y187中,制备HFF细胞Y187酵母文库。结果 HFF细胞总RNA的A260/A280值为2.02,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测到28S和18S核糖体特异性条带且二者亮度之比为2∶1,提取的RNA完整、质量良好。3种读码框库容分别为1.4×106 CFU/ml、1.8×106 CFU/ml和2.0×106 CFU/ml,重组率为99%。cDNA文库外源基因插入片段长度700～2 000bp。制备的HFF细胞酵母cDNA文库库容量为2.5×107 CFU/ml。结论构建的HF...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019年01期 第23-26页 北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
图１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ１．５％琼脂糖凝胶电泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ
匀弥散，且浓度提高（图２Ｂ）。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ图１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ１．５％琼脂糖凝胶电泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＦｉｇ．１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ｃＤＮＡ２均一化的ｃＤＮＡ图２ｃＤＮＡ合成及均一化电泳图Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ｃＤＮＡ２ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡＦｉｇ．２ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃＤＮＡａｎｄｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡ３ｃＤＮＡＳｆｉＩ酶切及纯化ｃＤＮＡ经过限制性内切酶ＳｆｉＩ酶切处理后，使用ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ对酶切ｃＤＮＡ进行过柱处理，去除短片段，１．５％琼脂糖凝胶电泳显示弥散状的ｃＤＮＡ均匀分布在５００～３０００ｂｐ处（图３），短片段得到有效去除。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ纯化后的ｃＤＮＡ图３ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ纯化ｃＤＮＡ的电泳分析Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥＦｉｇ．３ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ４初级文库库容检测酶切、纯化后的ｃＤＮＡ与ｐＧＡＤＴ７－ＳｆｉＩ三框表达载体连接、转化后，计算文库库容，３种读码框库容分别为１．４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１．８×１０６ＣＦＵ／ｍｌ和２．０×１
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【参考文献】：
期刊论文
[1]白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 薛进,李静,羊健,唐彦,梁瑶,陈剑平,张恒木. 浙江农业学报. 2017(12)
[2]灭蚊真菌-贵阳腐霉Pythium sp.GY1938菌株cDNA文库的构建及鉴定[J]. 杨平,李艳,张坤,余赟,杨亚琼,黄世梅,李敏惠. 中国病原生物学杂志. 2017(03)
博士论文
[1]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
本文编号：2907211
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019年01期 第23-26页 北大核心
【文章页数】：4 页
【部分图文】：
图１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ１．５％琼脂糖凝胶电泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ
匀弥散，且浓度提高（图２Ｂ）。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ图１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ１．５％琼脂糖凝胶电泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＦｉｇ．１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ｃＤＮＡ２均一化的ｃＤＮＡ图２ｃＤＮＡ合成及均一化电泳图Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ｃＤＮＡ２ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡＦｉｇ．２ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃＤＮＡａｎｄｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡ３ｃＤＮＡＳｆｉＩ酶切及纯化ｃＤＮＡ经过限制性内切酶ＳｆｉＩ酶切处理后，使用ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ对酶切ｃＤＮＡ进行过柱处理，去除短片段，１．５％琼脂糖凝胶电泳显示弥散状的ｃＤＮＡ均匀分布在５００～３０００ｂｐ处（图３），短片段得到有效去除。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ纯化后的ｃＤＮＡ图３ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ纯化ｃＤＮＡ的电泳分析Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥＦｉｇ．３ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ４初级文库库容检测酶切、纯化后的ｃＤＮＡ与ｐＧＡＤＴ７－ＳｆｉＩ三框表达载体连接、转化后，计算文库库容，３种读码框库容分别为１．４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１．８×１０６ＣＦＵ／ｍｌ和２．０×１
匀弥散，且浓度提高（图２Ｂ）。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ图１ＨＦＦ细胞总ＲＮＡ１．５％琼脂糖凝胶电泳Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＦｉｇ．１ＴｏｔａｌＲＮＡｏｆＨＦＦｃｅｌｌＭ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ｃＤＮＡ２均一化的ｃＤＮＡ图２ｃＤＮＡ合成及均一化电泳图Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ｃＤＮＡ２ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡＦｉｇ．２ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃＤＮＡａｎｄｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡ３ｃＤＮＡＳｆｉＩ酶切及纯化ｃＤＮＡ经过限制性内切酶ＳｆｉＩ酶切处理后，使用ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ对酶切ｃＤＮＡ进行过柱处理，去除短片段，１．５％琼脂糖凝胶电泳显示弥散状的ｃＤＮＡ均匀分布在５００～３０００ｂｐ处（图３），短片段得到有效去除。Ｍ２５０ｂｐＤＮＡ标志物１ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ纯化后的ｃＤＮＡ图３ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ纯化ｃＤＮＡ的电泳分析Ｍ２５０ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥＦｉｇ．３ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃＤＮＡｗｉｔｈＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ－１０００－ＴＥ４初级文库库容检测酶切、纯化后的ｃＤＮＡ与ｐＧＡＤＴ７－ＳｆｉＩ三框表达载体连接、转化后，计算文库库容，３种读码框库容分别为１．４×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１．８×１０６ＣＦＵ／ｍｌ和２．０×１
【参考文献】：
期刊论文
[1]白背飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建[J]. 薛进,李静,羊健,唐彦,梁瑶,陈剑平,张恒木. 浙江农业学报. 2017(12)
[2]灭蚊真菌-贵阳腐霉Pythium sp.GY1938菌株cDNA文库的构建及鉴定[J]. 杨平,李艳,张坤,余赟,杨亚琼,黄世梅,李敏惠. 中国病原生物学杂志. 2017(03)
博士论文
[1]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
本文编号：2907211
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