新型纳米微囊-VEGF复合体转染鼠成纤维细胞的体外试验研究

发布时间：2020-12-16 06:53

　　目的：探讨新型纳米微囊载体应用于基因治疗的可行性，安全性、转染效率、转移方法并与阳离子脂质体、质粒DNA进行比较。方法：以血管内皮细胞生长因子(VEGF₁₆₅)为目的基因，构建真核表达载体pcDNA3.1／myc-hisA^-VEGF₁₆₅，分别利用纳米微囊、阳离子脂质体介导VEGF₁₆₅转染鼠成纤维细胞（NIH3T3），转染4小时后镜下观察细胞转染后表型变化，48h后通过绿色荧光蛋白的表达观察瞬时转染效率，通过免疫组织化学、Western Blot检测基因表达水平及定位。MTT法检测对转基因细胞的毒性。ELISA检测经G418筛选后上清培养液VEGF蛋白持续表达情况。结果：经G418筛选后的阳性细胞克隆，为高表达VEGF的鼠成纤维细胞模型。免疫组织化学证实pcDNA3.1／myc-hisA^-VEGF₁₆₅在转基因的细胞中呈高表达，定位于胞浆。Western Blot结果显示纳米微囊转染NIH3T3后细胞胞浆及培养上清中均有VEGF蛋白表达。免疫荧光显示纳米... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

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前言和文献回顾
正文
    1 材料与方法
        1.1 材料
    2 方法
        2.1 大肠杆菌（TOP10）感受态的制备
- VEGF质粒转化大肠杆菌（TOP10）感受态">        2.2 pcDNA3.1／myc-hisA^- VEGF质粒转化大肠杆菌（TOP10）感受态
- VEGF质粒的少量制备">        2.3 pcDNA3.1／myc-hisA^- VEGF质粒的少量制备
        2.4 限制性内切酶酶切反应
        2.5 人源性VEGF基因片段的检测
        2.6 pIRES2-EGFP／VEGF质粒构建
        2.7 细胞培养及G418浓度的确定
        2.8 脂质体（Lipofectamine 2000）介导基因转染
        2.9 纳米微囊介导基因转染
165在细胞内表达的免疫组化检测">        2.10 VEGF₁₆₅在细胞内表达的免疫组化检测
        2.11 纳米微囊、脂质体介导的VEGF165蛋白表达水平的Western Blot分析
165蛋白表达的ELISA检测">        2.12 VEGF₁₆₅蛋白表达的ELISA检测
-VEGF敏感性">        2.13 MTT法检测NIH3T3细胞体外对脂质体和10mM的纳米微囊介导pcDNA3.1／myc-hisA^-VEGF敏感性
    3 结果
小结
参考文献
附录
个人简历和研究成果
致谢



本文编号：2919729