轮状病毒Rotateq及Rotarix疫苗VP8~*蛋白的原核表达、纯化与鉴定
发布时间:2020-12-26 11:53
目的 :通过大肠埃希菌原核表达体系,分别获得轮状病毒疫苗Rotateq及Rotarix的VP8*基因表达产物,为深入研究轮状病毒VP8*蛋白的结构和功能奠定基础。方法 :基因合成轮状病毒疫苗Rotateq及Rotarix的P[8]型VP8*基因序列,将其克隆到携带有GST标签的pGEX-4T1表达载体中构建重组质粒pGEX-4T1-VP8*,测序正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),通过SDS-PAGE电泳检测表达产物,并通过Glutathione Sepharose 4B纯化柱进行纯化,Western Blot鉴定。结果 :SDS-PAGE电泳结果显示分子量52KD处有深染带,Western-Blot显示该处蛋白能与GST标签抗体结合。结论 :成功构建了包含Rotateq及Rotarix VP8*基因的重组表达载体pGEX-4T1-VP8*,获得了可溶性GST-VP8*重组蛋白。
【文章来源】:湖南师范大学学报(医学版). 2019年03期
【文章页数】:4 页
【部分图文】:
AVP8*基因的PCR扩增(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*基因)
-6-学报(医学版),2019,16(3)JHunanNormalUniv(MedSci)RotarixVP8*基因为模板,以上述分别携带BamHI和XhoI限制性内切酶位点的vp8*-F与vp8*-R为上下游引物进行PCR循环,得到约为693bp的片段(图1A)。重组质粒pGEX-4T1-VP8*用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定,酶切产物电泳后显示的条带与VP8*基因及载体pGEX-4T-1的大小相符(图1B)。测序结果表明RotaTeq及RotarixVP8*基因重组表达质粒均构建成功。图1AVP8*基因的PCR扩增(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*基因)图1B重组质粒的酶切鉴定(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重组质粒的酶切结果)2.2重组质粒在大肠杆菌BL21的诱导表达将重组质粒pGEX-4T1-VP8*转化大肠杆菌BL21,在摇床上20℃诱导表达过夜。SDS-PAGE电泳结果显示,与未诱导全菌液相比,IPTG诱导后,上清液中出现了特异性条带(52KD),重组质粒得到可溶性表达(图2)。2.3重组蛋白的纯化在冰浴条件下超声破碎菌体后收集上清液,用滤过器过滤后经GlutathioneSepharose4B柱纯化,以PBS缓冲液充分洗去杂蛋白,最后用还原性谷胱甘肽洗脱目的蛋白,SDS-PAGE电泳显示,GST-vp8*融合蛋白大小约为52KD(图3)。2.4重组蛋白western-blot鉴定将纯化的蛋白进行Westernblot鉴定,结果显示,纯化融合蛋白能被GST标签抗体识别并结合,52KD处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明融合蛋白的确为GST-VP8*重组蛋白(图4)。图2重组质粒pGEX-4T1-VP8*的诱导表达(2和4分别为RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重组质粒的表达)图3重组蛋白的纯化(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-GST重组蛋白)图4重组蛋白的wester
52KD),重组质粒得到可溶性表达(图2)。2.3重组蛋白的纯化在冰浴条件下超声破碎菌体后收集上清液,用滤过器过滤后经GlutathioneSepharose4B柱纯化,以PBS缓冲液充分洗去杂蛋白,最后用还原性谷胱甘肽洗脱目的蛋白,SDS-PAGE电泳显示,GST-vp8*融合蛋白大小约为52KD(图3)。2.4重组蛋白western-blot鉴定将纯化的蛋白进行Westernblot鉴定,结果显示,纯化融合蛋白能被GST标签抗体识别并结合,52KD处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明融合蛋白的确为GST-VP8*重组蛋白(图4)。图2重组质粒pGEX-4T1-VP8*的诱导表达(2和4分别为RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重组质粒的表达)图3重组蛋白的纯化(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-GST重组蛋白)图4重组蛋白的western-blot鉴定(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-GST重组蛋白)3讨论轮状病毒是一种能经过粪口途径传播,引起婴幼儿重症腹泻的主要病原体之一,给世界各国,尤其是发展中国家带来了严重的经济负担,是世界范围的严重公共卫生问题[11]。针对轮状病毒感染,目前尚未研究出特效治疗药物,疫苗接种可以减少RVs腹泻、降低RVs致死率,2009年,WHO提出将轮状病毒疫苗纳入计划免
【参考文献】:
期刊论文
[1]确认我国轮状病毒疫苗株LLR基因型为G10P[15][J]. 李丹地,徐子乾,谢广成,刘娜,王宏,章青,孙晓曼,郭妮君,庞立丽,段招军. 病毒学报. 2015(02)
本文编号:2939647
【文章来源】:湖南师范大学学报(医学版). 2019年03期
【文章页数】:4 页
【部分图文】:
AVP8*基因的PCR扩增(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*基因)
-6-学报(医学版),2019,16(3)JHunanNormalUniv(MedSci)RotarixVP8*基因为模板,以上述分别携带BamHI和XhoI限制性内切酶位点的vp8*-F与vp8*-R为上下游引物进行PCR循环,得到约为693bp的片段(图1A)。重组质粒pGEX-4T1-VP8*用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定,酶切产物电泳后显示的条带与VP8*基因及载体pGEX-4T-1的大小相符(图1B)。测序结果表明RotaTeq及RotarixVP8*基因重组表达质粒均构建成功。图1AVP8*基因的PCR扩增(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*基因)图1B重组质粒的酶切鉴定(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重组质粒的酶切结果)2.2重组质粒在大肠杆菌BL21的诱导表达将重组质粒pGEX-4T1-VP8*转化大肠杆菌BL21,在摇床上20℃诱导表达过夜。SDS-PAGE电泳结果显示,与未诱导全菌液相比,IPTG诱导后,上清液中出现了特异性条带(52KD),重组质粒得到可溶性表达(图2)。2.3重组蛋白的纯化在冰浴条件下超声破碎菌体后收集上清液,用滤过器过滤后经GlutathioneSepharose4B柱纯化,以PBS缓冲液充分洗去杂蛋白,最后用还原性谷胱甘肽洗脱目的蛋白,SDS-PAGE电泳显示,GST-vp8*融合蛋白大小约为52KD(图3)。2.4重组蛋白western-blot鉴定将纯化的蛋白进行Westernblot鉴定,结果显示,纯化融合蛋白能被GST标签抗体识别并结合,52KD处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明融合蛋白的确为GST-VP8*重组蛋白(图4)。图2重组质粒pGEX-4T1-VP8*的诱导表达(2和4分别为RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重组质粒的表达)图3重组蛋白的纯化(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-GST重组蛋白)图4重组蛋白的wester
52KD),重组质粒得到可溶性表达(图2)。2.3重组蛋白的纯化在冰浴条件下超声破碎菌体后收集上清液,用滤过器过滤后经GlutathioneSepharose4B柱纯化,以PBS缓冲液充分洗去杂蛋白,最后用还原性谷胱甘肽洗脱目的蛋白,SDS-PAGE电泳显示,GST-vp8*融合蛋白大小约为52KD(图3)。2.4重组蛋白western-blot鉴定将纯化的蛋白进行Westernblot鉴定,结果显示,纯化融合蛋白能被GST标签抗体识别并结合,52KD处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明融合蛋白的确为GST-VP8*重组蛋白(图4)。图2重组质粒pGEX-4T1-VP8*的诱导表达(2和4分别为RotaTeq和RotarixVP8*-pGEX-4T-1重组质粒的表达)图3重组蛋白的纯化(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-GST重组蛋白)图4重组蛋白的western-blot鉴定(1和2分别为RotaTeq和RotarixVP8*-GST重组蛋白)3讨论轮状病毒是一种能经过粪口途径传播,引起婴幼儿重症腹泻的主要病原体之一,给世界各国,尤其是发展中国家带来了严重的经济负担,是世界范围的严重公共卫生问题[11]。针对轮状病毒感染,目前尚未研究出特效治疗药物,疫苗接种可以减少RVs腹泻、降低RVs致死率,2009年,WHO提出将轮状病毒疫苗纳入计划免
【参考文献】:
期刊论文
[1]确认我国轮状病毒疫苗株LLR基因型为G10P[15][J]. 李丹地,徐子乾,谢广成,刘娜,王宏,章青,孙晓曼,郭妮君,庞立丽,段招军. 病毒学报. 2015(02)
本文编号:2939647
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