成骨细胞与诱导剂对骨髓基质细胞的增殖与成骨分化的影响
发布时间：2020-12-27 04:39
目的:研究成骨细胞与诱导剂对骨髓基质细胞（MSCs）的增殖与分化的影响,探索一种新的骨组织工程种子细胞的体外培养体系。方法:骨髓基质细胞由于其强大增殖能力及多向分化潜能而成为骨组织工程的种子细胞。本实验研究乳大鼠颅骨来源的成骨细胞与诱导剂（地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸）对大鼠股骨、胫骨来源的MSCs生长的影响。实验共分4组,对照组:DMEM培养液培养MSCs;诱导剂组:成骨诱导液培养MSCs;成骨细胞组:在DMEM培养液中通过插入式培养皿以2:1的比例间接混合培养MSCs和成骨细胞,细胞因子可通过培养皿底部半透膜的微孔;联合诱导组:在成骨诱导液中进行如成骨细胞组的细胞间接混合培养。计数培养8d内每天的MSCs数量,绘制细胞生长曲线;检测培养10d时MSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性;检测细胞总蛋白量,计算ALP相对活性（即单位质量蛋白的ALP活性）;采用逆转录酶链反应（RT-PCR）检测培养2w后MSCs的骨钙素（OC）mRNA的表达量。结果:生长曲线显示8d内4组细胞数量均随培养时间延长而增加。3个诱导组分别与对照组比较:后4d内诱导剂组的细胞数量少于对照组而成骨细胞组的细胞数...
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
插入式培养皿置于24孔板中Fig1MillicellCellCulturePlateInsertin
3.2.3 干预实验3.2.3.1 干预前的准备插入式培养皿使用前在 DMEM 培养液中浸泡 2h。骨髓基质细胞的制备胰蛋白酶溶液消化生长良好的第 3 代骨髓基质细胞，胎牛血清终止消化，PB2 次，用 DMEM 培养液稀释细胞至密度为 5×104/ml，以每孔 1ml 细胞悬液孔板，共种植 4 块。培养 24 小时后备用。成骨细胞的制备：以上相同方法制×104/ml 的成骨细胞悬液，取 2 块 24 孔培养板，每孔先加入 0.5ml DMEM 放入插入式培养皿，皿中加入 0.5ml 已制备好的成骨细胞悬液，培养 24 小骨髓基质细胞与成骨细胞预培养 24h 利于细胞的适应诱导环境及同步化。3.2.3.2 干预过程吸去上述培养板及培养皿中的培养液，PBS 缓冲液洗 2 次。以每块有胞的 24 培养板对应一组进行实验。对照组：每孔加入 1ml DMEM 培养液；每孔加入 1ml 成骨诱导液；成骨细胞组：每孔先加入 0.5mlDMEM 培养液，骨细胞的 Millipore 插入式培养皿，皿中再加入 0.5mlDMEM 培养液 (图 1)，细胞因子可通过插入式培养皿底部的半透膜（图 2）；联合诱导组：每孔先加成骨诱导液，放入已有成骨细胞的 Millipore 插入式培养皿，皿中再加入 0.导液。每隔 3 天换液，使用培养孔中原用的相应培养液换液，有插入式培养培养皿内外各加 0.5ml 培养液的方法换液。以上所用培养液均含 20﹪的胎牛插
东南大学硕士学位论文四 结 果4.1 成骨细胞的鉴定4.1.1 形态学观察消化法所得的细胞种植24h后即可见大量细胞贴壁,少量死细胞悬浮于培养液中,贴壁细胞呈三角形、多边形、不规则形(图 4)。第 3 d 换液可除去悬浮细胞，培养 1w 细胞即可长满瓶壁。植块法：骨组织块种植于瓶壁 2d 后可见少量梭形细胞从植块边缘爬出，细胞成辐射状分布,培养 2w 相邻的植块长出的细胞汇合。传代培养的细胞一般 24h 内即已贴壁，细胞出现突起,培养 3d 左右细胞即可融合,1w 后细胞呈多层生长,镶嵌排列,, 细胞外基质分泌增多，并包裹细胞, 10d 后呈现明显“铺路石”状（图 5）,2w 后细胞间出现致密圆形结节, 结节逐渐增大呈黑色团块,团块呈突起的多层结构,轮廓模糊,中心区透光性弱，黑色团块即为钙结节。
本文编号：2941118
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
插入式培养皿置于24孔板中Fig1MillicellCellCulturePlateInsertin
3.2.3 干预实验3.2.3.1 干预前的准备插入式培养皿使用前在 DMEM 培养液中浸泡 2h。骨髓基质细胞的制备胰蛋白酶溶液消化生长良好的第 3 代骨髓基质细胞，胎牛血清终止消化，PB2 次，用 DMEM 培养液稀释细胞至密度为 5×104/ml，以每孔 1ml 细胞悬液孔板，共种植 4 块。培养 24 小时后备用。成骨细胞的制备：以上相同方法制×104/ml 的成骨细胞悬液，取 2 块 24 孔培养板，每孔先加入 0.5ml DMEM 放入插入式培养皿，皿中加入 0.5ml 已制备好的成骨细胞悬液，培养 24 小骨髓基质细胞与成骨细胞预培养 24h 利于细胞的适应诱导环境及同步化。3.2.3.2 干预过程吸去上述培养板及培养皿中的培养液，PBS 缓冲液洗 2 次。以每块有胞的 24 培养板对应一组进行实验。对照组：每孔加入 1ml DMEM 培养液；每孔加入 1ml 成骨诱导液；成骨细胞组：每孔先加入 0.5mlDMEM 培养液，骨细胞的 Millipore 插入式培养皿，皿中再加入 0.5mlDMEM 培养液 (图 1)，细胞因子可通过插入式培养皿底部的半透膜（图 2）；联合诱导组：每孔先加成骨诱导液，放入已有成骨细胞的 Millipore 插入式培养皿，皿中再加入 0.导液。每隔 3 天换液，使用培养孔中原用的相应培养液换液，有插入式培养培养皿内外各加 0.5ml 培养液的方法换液。以上所用培养液均含 20﹪的胎牛插
东南大学硕士学位论文四 结 果4.1 成骨细胞的鉴定4.1.1 形态学观察消化法所得的细胞种植24h后即可见大量细胞贴壁,少量死细胞悬浮于培养液中,贴壁细胞呈三角形、多边形、不规则形(图 4)。第 3 d 换液可除去悬浮细胞，培养 1w 细胞即可长满瓶壁。植块法：骨组织块种植于瓶壁 2d 后可见少量梭形细胞从植块边缘爬出，细胞成辐射状分布,培养 2w 相邻的植块长出的细胞汇合。传代培养的细胞一般 24h 内即已贴壁，细胞出现突起,培养 3d 左右细胞即可融合,1w 后细胞呈多层生长,镶嵌排列,, 细胞外基质分泌增多，并包裹细胞, 10d 后呈现明显“铺路石”状（图 5）,2w 后细胞间出现致密圆形结节, 结节逐渐增大呈黑色团块,团块呈突起的多层结构,轮廓模糊,中心区透光性弱，黑色团块即为钙结节。
本文编号：2941118
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