人PERK和ATF4基因siRNA腺病毒的构建及对软骨细胞凋亡的研究

发布时间：2017-04-10 08:11

  本文关键词：人PERK和ATF4基因siRNA腺病毒的构建及对软骨细胞凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨靶向构建的携带人蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)基因和活化转录因子4 (activiting transcription factor 4, ATF4)基因的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)重组腺病毒对软骨细胞凋亡的影响。方法应用AdEasyTM腺病毒载体系统,构建并包装重组腺病毒siPERK和siATF4。感染细胞后,通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测软骨细胞ATDC5中PERK和ATF4 mRNA和蛋白的表达。应用衣霉素(Tunicamycin, TM)建立内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)模型,观察当ATF4被沉默时,ATDC5细胞的增殖和凋亡情况,以及感染重组腺病毒siPERK时,SW1353细胞的增殖和凋亡情况；微团培养ATDC5和C3H10T1/2细胞,应用骨形态发生蛋白2 (Bone morphogenetic protein 2, BMP2)诱导细胞分化,分别在第1,3,5天时感染Ad-RFP、siPERK和siATF4重组腺病毒,采用FCM、TUNEL、免疫印迹和免疫组化等检测软骨细胞分化过程中的凋亡情况。结果成功构建并获得重组腺病毒siPERK和siATF4。重组腺病毒处理细胞48h后,ATDC5细胞中PERK和ATF4的mRNA和蛋白表达水平明显下降(P0.05)。在ERS状态下,siATF4感染后,与对照组相比较,ATDC5细胞的凋亡率明显降低(P0.05),增殖明显增加(P0.05)；siPERK重组腺病毒感染细胞后,SW1353细胞增殖增加(P0.05),凋亡率降低(P0.05)；在BMP2诱导细胞分化过程中,FCM结果显示,siPERK和siATF4重组腺病毒联合感染组细胞凋亡率逐渐升高,且高于对照组(P0.05)。免疫印迹和免疫组化实验结果与FCM结果一致。结论在ERS状态时,沉默ATF4可以促进软骨细胞增殖并抑制其凋亡；抑制PERK基因可以促进内质网应激状态下软骨肉瘤细胞的增殖,并抑制其凋亡；而在软骨细胞分化过程中,同时沉默PERK和ATF4可促进软骨细胞的凋亡。
【关键词】：PERK ATF4 BMP2 软骨细胞 凋亡
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3416
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 siPERK和siATF4重组腺病毒的构建与鉴定14-28
• 1 材料与方法14-24
• 2 结果24-27
• 3 讨论27-28
• 第二部分 内质网应激状态下siATF4重组腺病毒对ATDC5细胞凋亡的研究28-36
• 1 材料与方法28-30
• 2 结果30-35
• 3 讨论35-36
• 第三部分 内质网应激时siPERK对软骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响36-42
• 1 材料与方法36-37
• 2 结果37-41
• 3 讨论41-42
• 第四部分 软骨细胞分化过程中siPERK联合siATF4诱导内质网应激介导凋亡的研究42-51
• 1 材料与方法42-44
• 2 结果44-49
• 3 讨论49-51
• 全文总结51-53
• 参考文献53-56
• 文献综述：内质网应激与骨相关疾病的研究进展56-62
• 参考文献59-62
• 致谢62-63
• 攻读学位期间发表的学术论文63

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本文编号：296272