红斑丹毒丝菌的致病性研究及其表面蛋白的MALDI-TOF质谱分析

发布时间：2017-04-10 13:21

  本文关键词：红斑丹毒丝菌的致病性研究及其表面蛋白的MALDI-TOF质谱分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丹毒病是一种广泛分布于全世界的古老疾病,红斑丹毒丝菌是该疾病的主要病原体,其特殊的细胞壁结构赋予了其独特的生存方式,这种适应性极强的细菌对全世界的养殖业和公共卫生系统都是一大威胁。在本研究中,小鼠致病性试验、补体抗性试验和抗吞噬试验被用来比较红斑丹毒丝菌的致病性,分别以半致死剂量(LD50),血清敏感性和吞噬指数作为衡量标准。结果显示:S型红斑丹毒丝菌在小鼠毒力模型中表现出了很强的致病性,C43065株和C43311株的腹腔注射半致死剂量(LD50)分别为81.59 CFU和191.04CFU,而注射了R型红斑丹毒丝菌的小鼠全部正常。在抗吞噬指数这一项上,S型红斑丹毒丝菌也显著强于R型菌株。对血清中的补体成分的抵抗力的表现上,S型红斑丹毒丝菌的繁殖速率基本没有受到影响,明显强于繁殖速率降低了一倍的R型红斑丹毒丝菌。以groEL基因作为分子标记所进行的测序及系统发育分析结果表明,C43065株、C43001株C43309株和C43311株红斑丹毒丝菌的groEL基因长度全部为1614bp,能编码一个长537个氨基酸的热休克蛋白HPS60,这段基因序列与已公布的红斑丹毒丝菌标准株ATCC19414和扁导体丹毒丝菌标准株ATCC43339的groEL基因有着很高的相似性,16S rRNA编码基因的测序结果表明,长度为1351 bp的该段序列与上述两种标准株的同源性均为99%。通过MAGA软件的最大简约算法(maximum parsimony method)的进行的系统发育分析结果发现,四株细菌均属于在红斑丹毒丝菌属,已两个标准株作为对照参考的分析结果表明,在属内的种间鉴别上,groEL基因序列有着更高的分辨率。根据伯杰氏系统细菌学手册Jones的研究,红斑丹毒丝菌可按菌体形态、菌落大小、表面特征、透明度和颜色、边沿特征六项表型特征差异被分成S型和R型,分析结果表明具有强致病性的C43065株和C43001株属于S型,无致病性的C43309株和C43311株属于R型。为了研究导致红斑丹毒丝菌不同菌株致病性差异的原因,对C43065株、C43001株、C43309株和C43311株红斑丹毒丝的表面蛋白进行了分离提取,经蛋白电泳分离后,用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪对电泳条带中的蛋白进行了肽质量指纹图谱的鉴定分析。从鉴定比对结果中发现了10种与已报到的毒力因子相同或相似的蛋白,但并未发现各菌株的表面蛋白之间的种类差异。酶联接免疫吸附实验(ELISA)的特异性和敏感性能定量的反映针对特定抗原所产生的抗体水平。通过间接ELISA法检测发现,S型红斑丹毒丝菌的全菌体蛋白疫苗相比于R型红斑丹毒丝菌全菌体蛋白能刺激实验小鼠产生更高的抗体水平。与该结果想呼应的是,免疫保护实验的结果表明,S型红斑丹毒丝菌的全蛋白疫苗能对小鼠产生完全免疫保护,而C43309株和C43311株的全蛋白的保护率只能分别达到60%和70%。两个结果都验证了R型和S型红斑丹毒丝菌的抗原性是存在差异的.
【关键词】：红斑丹毒丝菌 致病性差异 表面蛋白 抗原性 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析
【学位授予单位】：吉首大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 第1章 绪论13-19
• 1.1 红斑丹毒丝菌的感染与传播13-14
• 1.2 红斑丹毒丝菌感染的防治14-15
• 1.3 致病因子的研究15-17
• 1.3.1 透明质酸酶15
• 1.3.2 唾液酸苷酶15-16
• 1.3.3 粘附因子16
• 1.3.4 荚膜16-17
• 1.3.5 其它表面蛋白17
• 1.4 研究内容及意义17-19
• 第2章 红斑丹毒丝菌不同菌株的致病性差异19-26
• 2.1 材料19-21
• 2.1.1 主要试剂19-20
• 2.1.2 主要仪器设备20-21
• 2.1.3 菌株21
• 2.1.4 实验材料21
• 2.2 方法21-22
• 2.2.1 小鼠毒力试验21
• 2.2.2 吞噬试验21-22
• 2.2.3 补体抗性试验22
• 2.3 结果与分析22-25
• 2.3.1 小鼠毒力实验22-23
• 2.3.2 抗吞噬能力23-24
• 2.3.3 补体抗性24-25
• 2.4 讨论25-26
• 第3章 分子鉴定和表型分析26-33
• 3.1 材料26-27
• 3.1.1 主要试剂26-27
• 3.1.2 主要仪器设备27
• 3.1.3 引物27
• 3.2 研究方法27-29
• 3.2.1 基因组DNA的提取27-28
• 3.2.2 16S r RNA基因的PCR扩增28
• 3.2.3 gro EL基因的PCR扩增28
• 3.2.4 系统发育树的构建28
• 3.2.5 生长条件偏好28
• 3.2.6 表型特征28-29
• 3.3 结果与分析29-32
• 3.3.1 16S r RNA基因和gro EL基因的PCR扩增29
• 3.3.2 16S r RNA基因序列的系统发生学分析29-30
• 3.3.3 表型特征30-31
• 3.3.4 温度偏好31-32
• 3.4 讨论32-33
• 第4章 表面蛋白的提取及质谱分析33-39
• 4.1 材料33-35
• 4.1.1 主要试剂33-34
• 4.1.2 主要仪器34-35
• 4.2 研究方法35-36
• 4.2.1 表面蛋白的制备和分离35-36
• 4.2.2 表面蛋白鉴定分析36
• 4.3 结果与分析36-38
• 4.3.1 表面蛋白的制备和分离36
• 4.3.2 表面蛋白的鉴定分析36-38
• 4.4 讨论38-39
• 第5章 交叉免疫保护及抗体的定量分析39-47
• 5.1 材料39-41
• 5.1.1 主要试剂39-41
• 5.1.2 主要仪器41
• 5.2 研究方法41-43
• 5.2.1 全菌体蛋白及Spa A蛋白的制备41-42
• 5.2.2 交叉免疫保护率的测定42-43
• 5.2.3 间接ELISA检测抗体水平43
• 5.3 结果与分析43-45
• 5.3.1 全菌体蛋白及Spa A蛋白的制备43
• 5.3.2 交叉免疫保护率的测定43-44
• 5.3.3 抗体定量分析44-45
• 5.4 讨论45-47
• 结束语47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-55
• 作者在学期间取得的学术成果55

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