超正电荷ZFN融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其功能的初步研究

发布时间：2017-04-11 04:02

  本文关键词：超正电荷ZFN融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其功能的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是一种感染人类免疫系统的病毒,可通过破环人的淋巴细胞影响细胞免疫和体液免疫过程,导致免疫系统瘫痪,对人类健康存在极大威胁。最新的研究结果表明,CCR5受体是HIV进入T细胞的共受体,因此破坏基因组中的CCR5基因或阻止CCR5基因表达成了阻断HIV侵染人类T细胞的一种新途径。本文运用Ni磁珠与Co磁珠亲和层析技术纯化出超正电荷ZFN融合蛋白,验证出该蛋白具有切割CCR5基因的活性,从而为后续阻断HIV进入T细胞以及HIV基因治疗提供了新思路。本文主要研究结果如下:1.超正电荷ZFN融合蛋白的表达运用IPTG对转化了p ET22b-(+)36GFP/ZFNL和p ET22b-(+)36YFP/ZFNR质粒的两种菌株进行诱导,然后分别在不同温度和不同IPTG浓度的条件下过夜培养,次日分别收集菌体进行超声破碎,SDS-PAGE检测蛋白分布情况。实验结果确定16℃,0.5m M IPTG诱导是融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR表达的最适条件。2.超正电荷ZFN融合蛋白纯化条件的摸索1)通过Ni磁珠亲和层析技术纯化+36GFP/ZFNL融合蛋白,发现高盐裂解液条件有利于此融合蛋白挂柱,后续洗脱可以有效获得该融合蛋白。2)+36YFP/ZFNR融合蛋白同样在高盐裂解液条件下有利于其挂柱,但后续洗脱困难,推测该融合蛋白与Ni磁珠结合过于牢固。然后运用了Co磁珠和已使用两次的Ni磁珠对该融合蛋白进行纯化,发现该方法可以有效获得+36YFP/ZFNR融合蛋白。3.重组质粒Pet22b/CCR5的构建以HCC1954细胞中的基因组DNA作为PCR扩增模板,有效获得人CCR5基因。随后将CCR5目的基因连接到质粒载体Pet22b,经菌落PCR,双酶切及基因测序等方法验证了CCR5基因无突变。4.超正电荷ZFN融合蛋白活性检测将重组质粒p ET22b/CCR5与上述纯化的两个超正电荷ZFN融合蛋白在37℃共孵育1h后,1%琼脂糖凝胶电泳检测,发现随着超正电荷ZFN融合蛋白摩尔量的增加,重组质粒p ET22b/CCR5被切割成线性质粒产物的量也在增加,表明ZFN蛋白活性功能在增强。同时,发现当超正电荷ZFN融合蛋白摩尔量增加到7n M后,该蛋白会对重组质粒p ET22b/CCR5产生非特异性切割。综上所述,我们在大肠杆菌中成功表达了超正电荷ZFN融合蛋白(+)36GFP/ZFNL和(+)36YFP/ZFNR,并利用Ni亲和层析技术对上述两种融合蛋白进行了纯化。在此基础上,本文还构建了重组质粒Pet22b/CCR5,验证了这一对超正电荷ZFN融合蛋白对靶基因的体外切割活性即ZFN融合蛋白对基因组DNA的编辑功能。本文为研究超正电荷ZFN融合蛋白在体内的活性奠定了坚实的理论基础,也为HIV基因治疗方法提供了新思路。
【关键词】：超正电荷ZFN融合蛋白 CCR5基因 HIV 亲和层析技术
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R373
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 第1章 综述10-19
• 1.1 HIV的流行概况10
• 1.2 CCR510-12
• 1.3 以CCR5为目标的HIV基因治疗方法概况12-14
• 1.3.1 小分子阻碍物13
• 1.3.2 针对CCR5的单克隆抗体13
• 1.3.3 具有编辑作用的趋化因子13-14
• 1.3.4 锌指核酸酶（ZFN）14
• 1.4 靶标CCR5基因治疗HIV的临床研究进展14-17
• 1.5 以+36GFP和+36YFP为载体的ZFN蛋白输送系统17
• 1.6 选题依据和研究意义17-18
• 1.7 研究内容及研究展望18-19
• 第2章 +36GFP-ZFNL融合蛋白的表达、纯化及定量分析19-37
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 质粒、菌株及试剂盒19
• 2.1.2 实验试剂19-20
• 2.1.3 实验设备20-21
• 2.2 实验方法21-30
• 2.2.1 主要溶液、缓冲液及培养基的配置21-23
• 2.2.2 质粒单双酶切23-24
• 2.2.3 融合蛋白小量诱导表达24-26
• 2.2.4 小量体积条件下纯化融合蛋白26-27
• 2.2.5 大量体积条件下纯化融合蛋白27-29
• 2.2.6 蛋白浓度测定29-30
• 2.3 实验结果30-36
• 2.3.1 pET22b/+36GFP-ZFNL质粒酶切验证30
• 2.3.2 BL21中+36GFP-ZFNL表达条件的优化30-32
• 2.3.3 BL21中+36GFP-ZFNL纯化方法的摸索32-34
• 2.3.4 +36GFP-ZFNL融合蛋白透析及浓缩34-35
• 2.3.5 +36GFP-ZFNL融合蛋白的浓度测定及其定量分析35-36
• 2.4 讨论36-37
• 第3章 +36YFP-ZFNR融合蛋白的表达、纯化及定量分析37-44
• 3.1 实验材料37
• 3.1.1 质粒、菌株及试剂盒37
• 3.1.2 实验试剂37
• 3.1.3 实验设备37
• 3.2 实验方法37
• 3.3 实验结果37-43
• 3.3.1 pET22b/+36YFP-ZFNR质粒酶切验证37-38
• 3.3.2 BL21中+36YFP-ZFNR融合蛋白表达条件的优化38-39
• 3.3.3 BL21中+36YFP-ZFNR融合蛋白的纯化39-42
• 3.3.4 +36YFP-ZFNR融合蛋白的浓度测定及定量分析42-43
• 3.4 讨论43-44
• 第4章 构建重组质粒pET22b/CCR544-62
• 4.1 实验材料44-45
• 4.1.1 质粒、菌株及试剂盒44
• 4.1.2 实验试剂44-45
• 4.1.3 实验设备45
• 4.2 实验方法45-55
• 4.2.1 培养HCC1954细胞并提取其基因组DNA45-46
• 4.2.2 CCR5目的基因片段的制备46-52
• 4.2.3 pET22b载体的制备52
• 4.2.4 pET22b/CCR5重组质粒的连接构建52-53
• 4.2.5 pET22b/CCR5鉴定-菌落PCR53-54
• 4.2.6 pET22b/CCR5鉴定-双酶切54-55
• 4.2.7 pET22b/CCR5鉴定-测序55
• 4.3 实验结果55-60
• 4.3.1 培养HCC1954细胞并提取其基因组DNA55-56
• 4.3.2 PCR扩增目的片段及纯化回收56-57
• 4.3.3 载体pET22b、PCR产物的双酶切后的纯化回收57-58
• 4.3.4 阳性重组质粒pET22b/CCR5的构建、筛选及鉴定58-60
• 4.4 讨论60-62
• 第5章 +36GFP-ZFNL和+36YFP-ZFNR融合蛋白体外活性检测62-67
• 5.1 实验材料62-63
• 5.1.1 蛋白、质粒及试剂62
• 5.1.2 实验设备62-63
• 5.2 实验方法63-64
• 5.2.1 配置reaction buffer缓冲液63
• 5.2.2 梯度稀释超正电荷ZFN融合蛋白至所需浓度63-64
• 5.2.3 超正电荷ZFN融合蛋白体外活性检测64
• 5.3 实验结果64-65
• 5.3.1 超正电荷ZFN融合蛋白作用于重组质粒pET22b/CCR564-65
• 5.3.2 反复冻融对超正电荷ZFN融合蛋白活性的影响65
• 5.4 讨论65-67
• 结论67-68
• 参考文献68-71
• 致谢71

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1 王璋瑜;;蛋白设计实验室公司买下融合蛋白技术实用权[J];生物技术通报;1990年10期

2 张毅,屈贤铭,杨胜利;融合蛋白基因工程应用及研究[J];生物工程进展;2000年03期

3 杨林,李国清,黄葆英,王全忠,龙綮新,王s阏

本文编号：298244