与CVB3 3A相互作用的人心脏蛋白的筛选及功能初探

发布时间：2017-04-11 05:22

  本文关键词：与CVB3 3A相互作用的人心脏蛋白的筛选及功能初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:运用酵母双杂交技术,从人心脏c DNA文库中筛选与CVB3非结构蛋白3A相互作用的人细胞蛋白;选取阳性蛋白之一的TMED4进行研究,探讨CVB3 3A与TMED4的相互作用及其生物学意义,为进一步研究CVB3的致病机制及治疗CVB3引起的相关疾病提供新的方向和依据。方法:1.以病毒RNA为模板,逆转录合成c DNA,再经PCR扩增出3A基因,并将其重组至真核表达质粒p GBKT7中,构建诱饵质粒p GBKT7-3A;2.采用乙酸锂法将诱饵质粒p GBKT7-3A转化至酵母菌AH109中;3.Western Blot检测融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A在酵母菌AH109[p GBKT7-3A]中的表达;4.SD/ Ade/ Trp和SD/ His/ Trp营养缺陷培养基及X-α-Gal实验检测3A对报告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的转录自激活作用,小规模配合实验检测酵母菌的配合功能;5.大规模配合筛选与3A蛋白相互作用的人细胞蛋白;6.采用表型鉴定、PCR扩增和Alu I酶切等实验方法对筛选所得阳性候选克隆进行归类、测序及同源性比对分析;7.SD/ Ade/ Leu和SD/ His/ Leu营养缺陷培养基的鉴定方法及X-α-Gal实验检测筛选所得阳性质粒p GADT7-ADx对报告基因(HIS3、ADE2和MEL1)的转录自激活作用,利用回返配合实验初步验证3A蛋白与各阳性蛋白的相互作用;8.质粒p Bud CE4.1-3A转染He La细胞36 h后,采用免疫荧光双标技术,用Alexa Flour 488山羊抗兔二抗(绿色荧光)与兔抗TMED4的特异性结合来标记TMED4在细胞内的定位,用Rhodamine山羊抗鼠二抗(红色荧光)与鼠抗His-Tag的特异性结合来标记3A在细胞中的定位,利用高内涵细胞成像分析系统观察3A蛋白与TMED4在细胞内的共定位情况,同时设立正常细胞作为阴性对照;9.质粒p Bud CE4.1-3A转染He La细胞48 h后,收集细胞蛋白裂解液,分别采用anti-TMED4或anti-His-Tag进行细胞内免疫共沉淀,进一步验证3A蛋白与阳性蛋白TMED4之间的相互作用;10.收集质粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1转染后24 h、36 h、48 h各时间点细胞,加入CCK-8溶液后酶标仪检测波长490 nm处各样品OD值,采用SPSS 13.0软件对结果进行分析;11.收集质粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1转染后24 h、36 h、48 h各时间点细胞,使用Annexin V试剂盒对早期凋亡细胞进行染色后,高内涵细胞成像分析系统对早期凋亡细胞进行计数分析;12.质粒p Bud CE4.1-3A对细胞周期的影响:以G1/S期为切入点,收集质粒p Bud CE4.1-3A和p Bud CE4.1转染后24 h、36 h、48 h、54 h各时间点的细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化;13.用质粒p Bud CE4.1-3A转染He La细胞18 h、24 h、36 h、40 h、48 h、54 h、60 h,采用MOI=5的CVB3感染He La细胞3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h,收集各时间点细胞蛋白裂解液,同时设立正常细胞和空质粒转染组细胞为对照,Western Blot检测细胞内TMED4的表达情况。结果:1.双酶切鉴定及测序结果提示3A已成功重组至p GBKT7载体的多克隆位点,且阅读框与病毒3A基因一致;2.表型鉴定和PCR法验证重组诱饵质粒p GBKT7-3A已成功转入酵母菌AH109中;3.3A能在酵母菌AH109[p GBKT7-3A]中表达并且对酵母菌无毒性作用;4.SD/ Ade/ Trp和SD/ His/ Trp营养缺陷培养基和酶底物X-α-Gal颜色的变化情况显示3A对报告基因无转录自激活作用,小规模配合实验表明3A蛋白在AH109中的表达不影响酵母菌的配合功能;5.以CVB3 3A为诱饵,经大规模配合实验,从人心脏c DNA文库中筛选得到52个阳性候选克隆;6.五十二个阳性候选克隆经Alu I酶切分析后可归为6类,通过测序和同源性比对,共获得6种不同类别的阳性蛋白:兰尼碱受体2(Ryanodine Receptor2,Ry R2),信号肽酶2(Signal peptidase complex subunit 2,SPCS2),跨膜蛋白emp24(Transmembrane emp24 protein transport domain containing 4,TMED4),细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I,COX1),细胞色素c氧化酶亚基III(Cytochrome c oxidase subunit III,COX3)和肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH7)/琥珀酸脱氢酶亚基D(Succinate dehydrogenase complex subunit D,SDHD);7.SD/ Ade/ Leu和SD/ His/ Leu营养缺陷培养基和酶底物X-α-Gal颜色的变化情况显示6种阳性蛋白对报告基因无转录自激活作用,回返配合实验初步验证6种阳性蛋白与3A蛋白存在相互作用;8.高内涵细胞成像分析系统显示宿主蛋白TMED4主要在胞浆中表达,而病毒蛋白3A主要表达在胞浆核周区域,提示3A与TMED4在细胞胞浆内存在共定位现象;9.在质粒p Bud CE4.1-3A转染后的细胞中,3A蛋白能够被anti-TMED4抗体共沉淀,而TMED4也能够被anti-His-tag抗体共沉淀。细胞内免疫共沉淀结果提示:在质粒p Bud CE4.1-3A转染后的细胞内,3A与TMED4能够发生相互作用;10.CCK-8法结果提示:质粒p Bud CE4.1-3A转染细胞后36 h时间点细胞活性与空质粒转染组相比明显下降,且差异具有统计学意义,而转染24 h和48 h时间点的细胞活性与空质粒转染组相比无明显差异;11.高内涵细胞成像分析系统观察早期凋亡细胞:质粒转染后36 h,3A转染组凋亡细胞数较空质粒转染组有明显增高,且差异具有统计学意义,而转染24 h和48 h时间点两组细胞并无明显差异;12.流式细胞仪检测结果显示:转染3A的细胞组G1期细胞比例一直高于转染空质粒的对照组,54 h细胞组G1期细胞比例差异具有统计学意义(P0.05),而S期、G2期的细胞比例没有明显变化。13.收集质粒转染和活病毒感染各时间点细胞蛋白裂解液,Western Blot检测结果:3A转染细胞后,细胞内的TMED4表达量逐渐下降,于转染36 h时间点达到最低,随后开始回升,至60 h后维持稳定;空质粒转染对照组细胞内TMED4表达量未发现明显改变;CVB3活病毒感染细胞后细胞内TMED4的表达逐渐下降,于感染9 h时间点达到最低,随后开始回升,正常细胞对照组TMED4表达量无明显改变。质粒转染实验和活病毒感染实验两项结果存在一致性。结论:1.以CVB3 3A为诱饵,应用酵母双杂交技术,成功从人心脏c DNA文库中筛选获得6种与3A相互作用的人心脏蛋白:Ry R2、SPCS2、TMED4、COX1、COX3和MYH7/SDHD;2.3A与阳性蛋白TMED4在细胞内可能存在相互作用;3.3A在细胞中的表达影响细胞的活性,并通过下调TMED4的表达量来参与细胞凋亡;
【关键词】：CVB3 非结构蛋白3A 酵母双杂交系统 蛋白相互作用
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.2
【目录】：

• 摘要3-7
• Abstract7-14
• 第1章 引言14-18
• 1.1 柯萨奇病毒B组3型（Coxsackievirus group B type 3,CVB3）14-15
• 1.2 3A蛋白15-16
• 1.3 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）16-17
• 1.4 本论文研究基础和研究意义17-18
• 第2章 材料与方法18-33
• 2.1 实验材料18-22
• 2.1.1 菌株18
• 2.1.2 质粒18
• 2.1.3 主要试剂18-19
• 2.1.4 主要设备19-20
• 2.1.5 各类培养基20-21
• 2.1.6 Western-Blot所用试剂21-22
• 2.2 实验方法22-33
• 2.2.1 p GBKT7-3A重组质粒的构建（图 2.1）22-24
• 2.2.2 重组质粒p GBKT7-3A在酵母菌AH109中的表达24-26
• 2.2.3 3A对报告基因的转录自激活检测26
• 2.2.4 检测 3A的表达对酵母菌配合的影响26-27
• 2.2.5 筛选与 3A相互作用的蛋白27-28
• 2.2.6 阳性候选克隆的初步分析28-29
• 2.2.7 质粒DNA瞬时转染29
• 2.2.8 免疫荧光双标29-30
• 2.2.9 细胞内免疫共沉淀30-31
• 2.2.10 CCK-8 检测 3A对Hela细胞的活性影响31
• 2.2.11 Annexin V检测 3A对细胞凋亡的影响31
• 2.2.12 流式细胞仪检测 3A对细胞周期的影响31
• 2.2.13 病毒感染Hela细胞31-33
• 第3章 结果33-46
• 3.1 CVB33A是一个适合用于酵母双杂交系统的诱饵蛋白33-36
• 3.1.1 重组质粒p GBKT7-3A的酶切鉴定33
• 3.1.2 重组质粒p GBKT7-3A的基因测序33-34
• 3.1.3 酵母菌AH109[p GBKT7-3A]的表型验证34
• 3.1.4 融合蛋白DNA-BD-c-Myc-3A表达的检测34
• 3.1.5 3A对报告基因无转录自激活作用34-35
• 3.1.6 3A对酵母配合功能的影响35-36
• 3.2 经大规模配合实验筛选得到6个相互作用的人心脏蛋白36-39
• 3.2.1 人心脏c DNA文库滴定36
• 3.2.2 大规模酵母配合实验的配合效率36
• 3.2.3 阳性候选克隆的初步分析36-39
• 3.3 3A与TMED4相互作用的进一步验证39-40
• 3.3.1 高内涵细胞成像分析系统观察 3A与TMED4存在细胞共定位39
• 3.3.2 细胞内免疫共沉淀检测 3A与TMED4的相互作用39-40
• 3.4 3A与TMED4的相互作用对细胞的影响40-46
• 3.4.1 CCK-8 检测 3A对He La细胞的活性影响40-41
• 3.4.2 Annexin V检测 3A对细胞凋亡的影响41
• 3.4.3 流式细胞仪检测 3A对细胞周期的影响41-43
• 3.4.4 3A对细胞中TMED4表达量的影响43-46
• 第4章 讨论46-53
• 4.1 与 3A相互作用的6个人细胞蛋白46-47
• 4.2 TMED447-48
• 4.3 CVB33A与TMED4相互作用的进一步确证48-49
• 4.4 细胞凋亡49-50
• 4.5 3A与细胞凋亡的关系50-53
• 第5章 结论与展望53-54
• 5.1 结论53
• 5.2 展望53-54
• 第6章 创新性54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-62
• 攻读学位期间的研究成果62-63
• 综述63-70
• 参考文献68-70

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