丙肝病毒全基因组cDNA克隆侵染细胞培养体系的建立

发布时间：2021-01-10 23:22

　　以含有丙肝病毒（Hepatitis C Virus,HCV）全基因组cDNA的重组质粒（pHCV）为材料,通过基因转染,重组痘病毒辅助使之在HeLa细胞中产生HCV病毒体,建立了一种新的HCV体外细胞培养系统。采用RT-PCR、荧光定量RT-PCR、链特异性RT-PCR、免疫印迹、免疫电子显微镜和电子显微镜负染技术跟踪检测HCV的复制、蛋白表达、装配、释放和二次感染情况,评估该细胞培养体系HCV的产生效率,检测结果如下: 1、RT-PCR、链特异性RT-PCR的检测结果显示,在转染的HeLa细胞内有HCV正、负链的合成。而荧光定量RT-PCR的测定结果表明,pHCV可在转染的HeLa细胞中高效复制HCV基因组,产生的HCV基因组达到10⁷基因拷贝/mL,远远高于病人血清中的HCV基因拷贝数,也高于迄今报道的HCV细胞培养体系的复制效率。且HCV基因拷贝数的增加是一个动态的变化过程,呈现先逐步升高,达到一个峰值后缓缓下降的趋势。 2、Western-blot检测结果显示,本培养体系中有HCV结构蛋白（E2,Core）和非结构蛋白（NS5）的表达,其分子量... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

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丙型肝炎病毒基因结构及多聚蛋白加工图(Bartensehlageretal，2001)

SA承担了同样的作用。NSSA磷酸化是通过目前仍不知道的细胞胞内激酶介导的l，1997;Reedetal，1997:Tanjietal，1995b)。此外，Ns5A蛋白可能参与了]FN诱染细胞的抗性作用。至少从分离的HCV株看来，NSSA能够结合PKR，使IFN处的病毒翻译水平不致降低(Galeetal，1997，1998)。在NSSA相当于所编码产物第2209一2248位氨基酸残丛的区域存在干扰素敏感区(sIDR)，被认为是不卜JiHCV对干扰素治疗反应性有差异的分子结构基础。NSSB经认定是HCV复制所赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。NSSB基因区是高度遗传保守的。不仅仅在的不同基因型间，而且与瘟病毒、黄病毒以及其他的RNA病毒比较，都是高度特别是具有作为RNA聚合酶特征序列的G一D一D位点在黄病毒、脊髓灰质炎病毒叶病毒中都是一致的(AIetal，1998;Behrensetal，1996:Lohmannetal，1997:ashitaetal，1998;Yuanetal，1997)。、丙肝病毒的复制

了卓有成效的工作。他们探索了HCV基因组适应性突变对病毒亚基因组RNA复制通过对26个不同适应性突变位点的HVC亚基因组复制子的复制效率进行比较，寻病毒NRA复制效率提高的保守性突变位点(如图1.4所示)。结果发现在非结构蛋的每一个突变位点几乎都会使HVC的复制效率有所提高。其中，位于NS3区的突病毒NRA复制效率提高影响不大，但当其与高适应性突变位点结合在一起时具有，可以使RNA的复制效率大大提高(Lohmnna.etal2003)。如位于NS3区的E1202G2801突变位点可以分别使HCV病毒RNA的复制效率提高14倍和7倍，而这两个突变合在一起时可以使突变效率提高25倍。当这两个突变位点与NSSA区的52197P共同起作用时复制效率会有更大的提高(Blightetal，2003)。位于Ns4B、Ns5A、N变位点是细胞高适应性突变位点，能使病毒RNA复制效率有较大的提高，但是这点间不具有协同效应。


本文编号：2969606