弓形虫核酸疫苗pcDNA 3 /GRA 1 的研究
发布时间：2021-03-02 11:16
目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1（GRA1）真核表达质粒，并观察重组质粒DNA接种诱导的保护性免疫应答。 方法：1、用免疫兔血清和2个单克隆抗体筛选弓形虫速殖子cDNA文库，对阳性克隆进行序列分析；2、采用聚合酶链反应（PCR）扩增出编码GRA1目的基因，用EcoRⅠ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR扩增、双酶切初步鉴定后作序列测定；3、大量制备并提取重组质粒pcDNA3／GRA1，肌肉注射法免疫小鼠；用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性抗体水平及PCR检测不同组织DNA中GRA1基因；用免疫荧光法（IFA）检测GRA1蛋白在肌肉组织中的表达；用弓形虫RH株速殖子攻击感染免疫鼠，并观察其存活时间。 结果：1、通过筛选弓形虫cDNA文库，共获得12个阳性克隆。经序列测定发现插入片段的大小在450bp-2400bp之间，查询所有基因库并经EPAS（Expert Protein Analysis System）软件分析鉴定出 3个新的基因，分别命名为Toxo-W5，T...
【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：40 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
弓形虫速殖子cDNA文库免疫筛选结果.阳性克隆的第三次筛选
论文弓形虫真核表达质粒PcDNA3/GRAI的构建及序列测定条与GRAI基因ORF片段大小一致的条带，约为573bp;将重组子用反解I和肋口I双酶切后出现两条带，即5.4Kb、0.57Kb(图2一2);测序结果表明，该重组子含有GRAIORF基因片段(图2一3)。图2一1.PCR扩增的GRAIO盯图2一2.重组子双酶切结果Fig.2一1AgarosegeleleetroPhoresisOfGRAIeneodinggeneobtainedbyPCRl:GRA12:Marker(kb)Fig.2一2RecombinantPcDNA3/GRA1digestedbyEeoRI/Xholl:PeDNA3/GRA12:Marker(kb)TAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCCATGGTGCGTGTGAGCGCTATTGTCGGAGCTGCTGCATCGGTGTTCGTGTGCCTGTCTGCCGGCGCTTACGCTGCCGAAGGCGGCGACAACCAGTCGAGCGCCGTCTCAAATCGGGCGTCTCTCTTTGGTTTGCTGAGTGGAGGGACAGGGCAGGGATTAGG^^丁eeGAG^^丁e丁G丁^彝A丁蘸丁G。^e^下GA丁。eGoAAeAee丁A丁e。下G丁GG^GAG^eeeAeAGGCAACCCGGACTTGCTCAAGATCGCCATTAAAGCTTCAGATGGATCGTACAGCGAAGTCGGCAATGTTAACGTGGAGGAGGTGATTGATACTATGAAAAGCATGCAGAGGGACGAGGACATTTTCCTTCGTGCGTTGAACAAAGGCGAAACAGTAGAGGAAGCGATCGAAGACGTGGCTCAAGCAGAAGGGTTTAATTCGGAGCAAACCCTGCAACTGGAAAATGCAGTGAGCGCGGTGGCGTCTGTTGTTCAAGACGAGATGAAGGTGATCGACGATGTGCAGCAGCTTGAAAAGGACAAACAACAGCTTAAGGATGACATTGGGTTCCTAACAGGAGAGAGAGAGTAATTGGAGGTAGCTTTGTTGTGATCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCC图2一3.重组子GRAIORF序歹，!Fig.2一3SequeneeofreeombinantGRAIO盯(下划线部分为引物位置Underlinedpartindieatingprimers
弓形虫PcDNA3/GRAI重组质粒免疫小鼠的保护性效果观察图3一1不同免疫组小鼠的组织DNAPCR产物凝胶电泳分析M:Marker(bp)1:pcDNA3/GRAI双酶切结果2:pcDNA3/GR^1免疫小鼠的肌肉3:poDNA3免疫小鼠的肌肉4:生理盐水对照组小鼠的肌肉5:peDNA3/GRAI免疫小鼠的血细胞6:pcDNA3免疫小鼠的血细胞7:生理盐水对照组小鼠的血细胞Fig.3一1Agarosegel一eleetroPhoresisoftissueDNAPCRProduetsofvariousimmunitedgrouPsM:Markerl:PeDNA3/GRAIdigestedbyEeoRI/Xho1.2:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3/GRAI.3:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3.4:MuseleofmieeimmunizedwithNS.5:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3/GRAI.6:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3.7:BloodeellsofmieeimmunizedwithNS.欢，撬，!一襄鹦一，缨图3一2pcDNA3/GRAI免疫小鼠的不同组织DNAPCR产物检测1:肝脏2:心脏3:脾脏4:肺脏5:血液6:肾脏7:肌肉Fig.3一2PCRProduetsfromdifferenttissuesofmiceimmunizedWithPeDNA3/GRAI.l:liverZ:heart3:sPleen4:lungs:blood6:kidney7:musele3.2.3免疫荧光法检测GRAI基因在小鼠肌细胞的表达用弓形虫免疫兔血清同时检测三组小鼠肌肉组织切片中GRAI表达情况，在pcDNA3/GRAI免疫组肌细胞上可见呈点状或片状分布的荧光反应(图3一3)，而pcDNA3和NS免疫组无阳性反应(图3一4)。表明GRAI在pcDNA3/GRAI免疫组小鼠的肌细胞内获得表达。3.2.4抗攻击感染的免疫保护作用于免疫后的第5周经腹腔注射约500
【参考文献】：
期刊论文
[1]弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定[J]. 蔡力汀,舒衡平,蒋立平,吴翔,王丹静. 湖南医科大学学报. 2003(03)
[2]具有保护性及诊断价值的弓形虫单克隆抗体的研制[J]. 吴翔,舒衡平. 湖南医科大学学报. 2002(05)
[3]弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定[J]. 贾雪梅,陈观今,郭虹,郑焕钦. 中国人兽共患病杂志. 2002(03)
[4]弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究[J]. 占国清,吴少庭,李国光,高世同,林敏,郑春福. 中国寄生虫病防治杂志. 2001(04)
[5]弓形虫P22编码基因真核表达质粒接种小鼠后的细胞免疫效果[J]. 高世同,吴少庭,林敏,占国清,郑春福. 中国人兽共患病杂志. 2000(06)
[6]保护性免疫血清及单克隆抗体筛选日本血吸虫成虫cDNA文库[J]. 沈际佳,蒋作君,余新炳,汪学龙,吴忠道. 中国人兽共患病杂志. 2000(03)
[7]弓形虫疫苗的研究进展[J]. 龚娅,陈晓光. 中国人兽共患病杂志. 2000(01)
[8]弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答[J]. 郭虹,陈观今,郑焕钦,周永安,吕芳丽. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 1999(06)
[9]含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用[J]. 郭虹,陈观今,郑焕钦. 中国人兽共患病杂志. 1999(06)
[10]弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究[J]. 周永安,陈观今,郭虹,郑焕钦. 中国人兽共患病杂志. 1999(05)
本文编号：3059170
【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：40 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
弓形虫速殖子cDNA文库免疫筛选结果.阳性克隆的第三次筛选
论文弓形虫真核表达质粒PcDNA3/GRAI的构建及序列测定条与GRAI基因ORF片段大小一致的条带，约为573bp;将重组子用反解I和肋口I双酶切后出现两条带，即5.4Kb、0.57Kb(图2一2);测序结果表明，该重组子含有GRAIORF基因片段(图2一3)。图2一1.PCR扩增的GRAIO盯图2一2.重组子双酶切结果Fig.2一1AgarosegeleleetroPhoresisOfGRAIeneodinggeneobtainedbyPCRl:GRA12:Marker(kb)Fig.2一2RecombinantPcDNA3/GRA1digestedbyEeoRI/Xholl:PeDNA3/GRA12:Marker(kb)TAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCCATGGTGCGTGTGAGCGCTATTGTCGGAGCTGCTGCATCGGTGTTCGTGTGCCTGTCTGCCGGCGCTTACGCTGCCGAAGGCGGCGACAACCAGTCGAGCGCCGTCTCAAATCGGGCGTCTCTCTTTGGTTTGCTGAGTGGAGGGACAGGGCAGGGATTAGG^^丁eeGAG^^丁e丁G丁^彝A丁蘸丁G。^e^下GA丁。eGoAAeAee丁A丁e。下G丁GG^GAG^eeeAeAGGCAACCCGGACTTGCTCAAGATCGCCATTAAAGCTTCAGATGGATCGTACAGCGAAGTCGGCAATGTTAACGTGGAGGAGGTGATTGATACTATGAAAAGCATGCAGAGGGACGAGGACATTTTCCTTCGTGCGTTGAACAAAGGCGAAACAGTAGAGGAAGCGATCGAAGACGTGGCTCAAGCAGAAGGGTTTAATTCGGAGCAAACCCTGCAACTGGAAAATGCAGTGAGCGCGGTGGCGTCTGTTGTTCAAGACGAGATGAAGGTGATCGACGATGTGCAGCAGCTTGAAAAGGACAAACAACAGCTTAAGGATGACATTGGGTTCCTAACAGGAGAGAGAGAGTAATTGGAGGTAGCTTTGTTGTGATCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCC图2一3.重组子GRAIORF序歹，!Fig.2一3SequeneeofreeombinantGRAIO盯(下划线部分为引物位置Underlinedpartindieatingprimers
弓形虫PcDNA3/GRAI重组质粒免疫小鼠的保护性效果观察图3一1不同免疫组小鼠的组织DNAPCR产物凝胶电泳分析M:Marker(bp)1:pcDNA3/GRAI双酶切结果2:pcDNA3/GR^1免疫小鼠的肌肉3:poDNA3免疫小鼠的肌肉4:生理盐水对照组小鼠的肌肉5:peDNA3/GRAI免疫小鼠的血细胞6:pcDNA3免疫小鼠的血细胞7:生理盐水对照组小鼠的血细胞Fig.3一1Agarosegel一eleetroPhoresisoftissueDNAPCRProduetsofvariousimmunitedgrouPsM:Markerl:PeDNA3/GRAIdigestedbyEeoRI/Xho1.2:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3/GRAI.3:MuseleofmieeimmunizedwithPeDNA3.4:MuseleofmieeimmunizedwithNS.5:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3/GRAI.6:BloodeellsofmieeimmunizedwithPcDNA3.7:BloodeellsofmieeimmunizedwithNS.欢，撬，!一襄鹦一，缨图3一2pcDNA3/GRAI免疫小鼠的不同组织DNAPCR产物检测1:肝脏2:心脏3:脾脏4:肺脏5:血液6:肾脏7:肌肉Fig.3一2PCRProduetsfromdifferenttissuesofmiceimmunizedWithPeDNA3/GRAI.l:liverZ:heart3:sPleen4:lungs:blood6:kidney7:musele3.2.3免疫荧光法检测GRAI基因在小鼠肌细胞的表达用弓形虫免疫兔血清同时检测三组小鼠肌肉组织切片中GRAI表达情况，在pcDNA3/GRAI免疫组肌细胞上可见呈点状或片状分布的荧光反应(图3一3)，而pcDNA3和NS免疫组无阳性反应(图3一4)。表明GRAI在pcDNA3/GRAI免疫组小鼠的肌细胞内获得表达。3.2.4抗攻击感染的免疫保护作用于免疫后的第5周经腹腔注射约500
【参考文献】：
期刊论文
[1]弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定[J]. 蔡力汀,舒衡平,蒋立平,吴翔,王丹静. 湖南医科大学学报. 2003(03)
[2]具有保护性及诊断价值的弓形虫单克隆抗体的研制[J]. 吴翔,舒衡平. 湖南医科大学学报. 2002(05)
[3]弓形虫GRA1基因的体外扩增、克隆及鉴定[J]. 贾雪梅,陈观今,郭虹,郑焕钦. 中国人兽共患病杂志. 2002(03)
[4]弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究[J]. 占国清,吴少庭,李国光,高世同,林敏,郑春福. 中国寄生虫病防治杂志. 2001(04)
[5]弓形虫P22编码基因真核表达质粒接种小鼠后的细胞免疫效果[J]. 高世同,吴少庭,林敏,占国清,郑春福. 中国人兽共患病杂志. 2000(06)
[6]保护性免疫血清及单克隆抗体筛选日本血吸虫成虫cDNA文库[J]. 沈际佳,蒋作君,余新炳,汪学龙,吴忠道. 中国人兽共患病杂志. 2000(03)
[7]弓形虫疫苗的研究进展[J]. 龚娅,陈晓光. 中国人兽共患病杂志. 2000(01)
[8]弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答[J]. 郭虹,陈观今,郑焕钦,周永安,吕芳丽. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 1999(06)
[9]含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用[J]. 郭虹,陈观今,郑焕钦. 中国人兽共患病杂志. 1999(06)
[10]弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究[J]. 周永安,陈观今,郭虹,郑焕钦. 中国人兽共患病杂志. 1999(05)
本文编号：3059170
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