PI3K/Akt通路重要分子的相互作用筛选及初步研究

发布时间：2021-03-07 03:41

　　肝脏是人体内综合性的“生物化学工厂”，承担多种生理功能。蛋白质-蛋白质相互作用是一切生命活动的基础，研究肝脏蛋白质在相互作用中形成的复杂网络是全面认识肝脏生理功能、理解其分子调控机理的重要手段。细胞生长因子在肝脏生长发育、损伤和修复及功能调控中起关键作用。与肝脏相关的生长因子包括HGF、EGF、insulin、TGFs等，激活MAPK、PI3K/Akt、SMAD等多条主要信号途径，引起肝细胞增殖、存活、细胞迁移、管状结构发生等多种生物学效应。开展肝脏相关生长因子信号途径蛋白相互作用网络研究，是中国人类肝脏蛋白质组计划（CNHLPP）之蛋白质相互作用连锁图研究专题的重要组成部分。蛋白质丝/苏氨酸激酶Akt调控包括细胞存活、增殖、生长、凋亡和糖原代谢在内的多种生物学事件，在细胞增殖、凋亡、细胞迁移和葡萄糖代谢等过程中充当着关键角色。本课题以PI3K/Akt通路重要分子为诱饵，采用酵母双杂交方法筛选人肝脏cDNA文库，从蛋白质-蛋白质相互作用的角度，对肝脏相关生长因子信号途径的蛋白质相互作用网络进行初步研究。本文成功构建了31个诱饵载体，包括PI3K/Akt通路的关键节点、激酶、负调控分子和... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

PI3玲A旅信号通路

2.1.2文库代表性及其插入片段大小从滴度测定平板上随机挑取23个克隆，以pPC86多克隆位点两端序列为引物进行菌落PCR扩增文库的插入片段，PCR扩增结果如图2.3。图2.3文库菌落插入片段PCR结果。泳道1为DNA分子量标准DLZooo，其余泳道为文库菌落插入片段PCR产物。引自刘琼明博士论文。从上图可以看出，23个随机挑取的克隆中21个克隆有明显扩增;插入片段大都在1.Okb以上，少数(4/23)克隆插入片段大于2.Okb，平均大小在1.skb一2.Okb之间。2.1.3文库扩增不论是文库的滴度、文库的代表性还是文库的平均插入片段大小，都与文库说明书基本相符，满足YZH筛库的需求，我们随即对文库进行了扩增:100川文库稀释后涂布在360块150~LB/Amp平板上

需要检测诱饵(pDBLeu一X)的自激活情况。将pDBL￡u一X和AD空载体(pPC86)共转酵母细胞MaV203，将长出的克隆复制到3AT浓度分别为25、50、75、100~o讥的SC一Leu~T印一His平板上进行自激活检测(图2.4)。如果MaVZ仍(pDBLeu一x+PPC86)在100~oUL的平板上还能生长，则诱饵自身自激活活性太强。对于在低于100们 nrnol/L3AI，平板上不能生长的克隆，抑制其生长的3AT浓度即为相应诱饵筛选文库时选择性平板所需的3AT浓度(表2.4)。

【参考文献】：
期刊论文
[1]大规模酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用的应用[J]. 吴志豪,王建,贺福初.  遗传. 2006(12)

博士论文
[1]人类肝脏氧化应激反应和氧化还原调控网络的初步研究[D]. 刘琼明.中国人民解放军军事医学科学院 2006



本文编号：3068340