抗CD133纳米抗体的制备及细胞毒性肽的活性分析

发布时间：2017-04-15 22:21

  本文关键词：抗CD133纳米抗体的制备及细胞毒性肽的活性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前倾向于认为肿瘤干细胞是恶性肿瘤难治和对化疗耐药的根源之一。因此,对肿瘤干细胞表面标志分子的鉴定和功能研究,以及开发基于这些分子的靶向药物成为提高肿瘤治疗效果的手段之一。CD133是一个五次跨膜糖蛋白,在多种恶性肿瘤细胞以及肿瘤干细胞表面高表达,是鉴定肿瘤干细胞最常用的标志物之一。目前获得的抗CD133的抗体包括AC133、293C3和AC141等主要用于鉴别CD133+表达的干细胞亚群,并不具有对肿瘤干细胞的治疗作用。因此,有必要开发靶向CD133并具有治疗作用的新抗体药物。由于当前对CD133分子在干细胞中的生物学功能不甚了解,对设计靶向CD133的功能性抗体带来了困难。所以,当前靶向CD133治疗抗体的主要策略是与细胞毒性药物进行偶联。其中一种方法是与细胞毒性肽,如大肠杆菌毒素分子(Colicin Ia)、蛙皮素抗菌肽(Brevinin-2R)、假单胞菌外毒素A-PE38以及KDEL肽,进行分子融合或偶联。另外,直接在抗体分子上偶联毒性更强的化疗药物,如单甲基澳瑞他汀等,越来越成为制备抗体-药物偶联物的主要趋势。已有研究表明,这些细胞毒制剂与抗CD133抗体融合可以显著地抑制多种肿瘤组织及肿瘤干细胞的生长。纳米抗体是在骆驼科动物免疫系统中发现的天然缺失轻链的重链抗体可变区片段,是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子,具有水溶性高、制备成本低和可结合常规抗体不易结合抗原表位等优点。在制备抗体-药物偶联物中,因纳米抗体的单域抗体特性,偶联药物后对其抗原结合活性影响甚微。这使得纳米抗体在制备抗体-药物偶联物中更具优势。因此,本研究的目的在于获得高亲和力的抗CD133的纳米抗体并与Colicin Ia蛋白或Brevinin-2R分子进行偶联或分子融合制备抗体-毒素复合物,以期将抗体的靶向作用与毒素分子的抗肿瘤作用结合起来,从而获得一种对肿瘤及其干细胞具有显著杀伤作用的治疗制剂。基于此,本研究首先采用DNA重组技术构建包含CD133胞外区(CD133-ECD)的原核表达载体pET28a-CD133-ECD。利用IPTG诱导表达CD133-ECD蛋白,采用Ni-离子亲和色谱纯化诱导表达的CD133-ECD蛋白。将纯化蛋白对新西兰兔和新疆双峰驼进行免疫,以获得兔源和骆驼源抗CD133-ECD蛋白的多克隆抗体,用于分析抗体对CD133蛋白的结合情况。其次,从新疆双峰驼骆驼外周血淋巴细胞中提取总RNA,构建骆驼纳米抗体噬菌体展示文库,并用纯化的CD133-ECD蛋白对噬菌体展示文库进行亲和筛选以得到对CD133-ECD有结合力的候选抗体。进一步,采用ELISA和Western blot方法对获得的候选纳米抗体的抗原结合活性进行鉴定。最后,采用细胞增殖实验对重组表达获得的Colicin Ia和Brevinin-2R毒性蛋白分子对B16细胞、Skov-3细胞和Caov-3细胞的生长抑制作用进行检测,为将来制备抗体与细胞毒性肽的偶联或融合物提供实验基础。结果表明,原核表达载体pET28a-CD133经过诱导表达,获得了纯度大于90%的CD133-ECD重组蛋白,从免疫的家兔和骆驼血清中获得了效价分别为1:500000和1:1024000的抗CD133-ECD多克隆抗体。两种多抗在ELISA检测中均与CD133-ECD有特异结合作用。采用噬菌体展示技术构建了库容量为1.4×109 cfu的单域抗体库。菌落PCR和序列测定均表明该抗体库具有95%以上的多样性。采用亲和淘洗经过三轮筛选。从第三轮筛选获得的噬菌体克隆中经过菌落PCR和序列分析,选择了3株阳性噬菌体克隆并亚克隆到p ET28a表达载体中,在大肠杆菌BL21细胞中进行诱导表达和纯化了获得了VHH-13纳米抗体利用ELISA检测抗体的抗原特异性,发现VHH-13纳米抗体与CD133-ECD蛋白具有特异结合活性。另外,采用CCK-8检测结果表明Colicin Ia蛋白对Cavo-3细胞、Skov-3细胞、B16细胞无明显抑制作用,Brevinin-2R对Skov-3细胞、B16细胞有显著抑制作用。本研究通过噬菌体展示技术获得了一株对CD133-ECD蛋白具有特异结合活性的纳米抗体VHH-13,通过DNA重组技术获得了对几种肿瘤细胞具有明显抑制作用的Brevinin-2R肽分子。这些结果为进一步制备纳米抗体-毒性分子偶联物,及开展抗肿瘤及干细胞抑制作用提供了实验基础,也为开发新一代抗体药物奠定了基础。
【关键词】：纳米抗体 噬菌体展示技术 CD133 Brevinin-2R 抗肿瘤作用
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 英文缩略词7-12
• 第一部分 文献综述12-24
• 第一章 肿瘤干细胞与肿瘤微环境之间的关系12-20
• 1 肿瘤干细胞12
• 2 TICs与微环境之间的关系12-13
• 3 TICs的多种表面标志物13-14
• 4 CD133结构及表面标志物14-16
• 5 靶向TICs标志物的研究进展16-17
• 参考文献17-20
• 第二章 抗体-药物融合物导向治疗研究概况20-24
• 1 抗体简介20
• 2 ADCs的研究进展20-21
• 3 Colicin Ia及蛙皮抗菌肽简介21-22
• 参考文献22-24
• 第二部分 实验研究24-69
• 第一章 抗CD133胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定24-32
• 摘要24-25
• 1 材料与方法25-27
• 1.1 材料25-26
• 1.2 方法26-27
• 2 结果27-30
• 2.1 重组质粒pET28a-CD133的构建与鉴定27
• 2.2 CD133-606的原核表达及融合蛋白的纯化27-28
• 2.3 抗体效价的测定28-29
• 2.4 Western Blot检测多抗的特异结合活性29-30
• 3 讨论30
• 参考文献30-32
• 第二章 非免疫骆驼单域抗体库的构建及筛选32-49
• 摘要32
• 1 材料32-33
• 2 实验方法33-40
• 2.1 新疆双峰驼天然抗体库的构建及评估33-38
• 2.2 骆驼重链抗体天然噬菌体展示文库的表达38-39
• 2.3 CD133-606抗原蛋白对噬菌体展示文库的筛选39-40
• 3 结果40-46
• 3.1 骆驼VHH抗体基因的准备：40-41
• 3.2 pMECS载体的准备41-42
• 3.3 转化效率计算和骆驼天然抗体库库容估算42-43
• 3.4 新疆双峰驼噬菌体展示文库的构建及筛选43-46
• 4 讨论46-47
• 参考文献47-49
• 第三章 抗CD133_(-606)纳米抗体的初步鉴定49-62
• 摘要49-50
• 1 材料50-51
• 1.1 菌种及载体50
• 1.2 试剂50
• 1.3 培养基及溶液配制50-51
• 1.4 亚克隆引物设计51
• 2 方法51-55
• 2.1 小量诱导TG1-pMECS-VHH-X表达蛋白51
• 2.2 小量诱导HB2151-pMECS-VHH-X表达VHH蛋白51
• 2.3 小量诱导BL21-pMECS-VHH-X表达VHH蛋白51
• 2.4 重复序列测序51-52
• 2.5 验证VHH-02抗体蛋白与CD133蛋白结合活性52-54
• 2.6 构建pET28a-VHH07，，pET28-VHH13，pET28a-VHH35重组载体54-55
• 3.结果55-59
• 3.1 VHH-02蛋白的诱导表达及纯化55
• 3.2 三轮筛选获得的重复序列的亚克隆55-59
• 4 讨论59-60
• 参考文献60-62
• 第四章 大肠杆菌毒素分子和蛙皮素抗菌肽诱导表达及毒性检测62-69
• 摘要62-63
• 1 材料63-64
• 1.1 菌种和肿瘤细胞株63
• 1.2 试剂63
• 1.3 细胞培养所需试剂63-64
• 2 方法64
• 2.1 诱导表达Colicin Ia蛋白和Brevinin-2R蛋白表达及纯化64
• 2.2 CCK-8 检测Colicin Ia蛋白及Brevinin-2R对癌细胞的生长抑制作用64
• 3 结果64-66
• 3.1 Colicin Ia蛋白的表达纯化65
• 3.2 Brevinin-2R蛋白的诱导表达65-66
• 3.3 CCK-8 检测两种细胞毒性肽对癌细胞的生长抑制作用66
• 4 讨论66-67
• 参考文献67-69
• 总结69-70
• 展望70-71
• 致谢71-72
• 个人简历72
• 参与课题及发表文章72-73
• 参与课题72-73

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 何莲;刘骞;冯济龙;黄波;;肿瘤干细胞标志物Oct4和ALDH1A1在乳腺癌组织中的表达及临床意义[J];解剖学研究;2014年05期

2 孙明立;赵海山;肖庆环;于兆进;姚维凡;唐宏涛;关舒;金锋;魏敏杰;;ALDH1A1在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义[J];解剖学研究;2015年03期

3 李志鹏;李p

本文编号：309384