氯化铵对人正常肝细胞系changliver中二氢乳清酸脱氢酶表达的影响

发布时间：2017-04-17 03:18

  本文关键词：氯化铵对人正常肝细胞系changliver中二氢乳清酸脱氢酶表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景肝脏(liver)是人体内最大的消化腺和最大的实质性器官,肝脏的功能十分复杂、多样,在人体的物质代谢中占有极其重要的地位,其与三大有机物的代谢、转化及解毒等机能密切相关[1]。当各种原因引起肝脏发生严重病变时(如重症肝炎、肝硬化、肝细胞癌),肝脏丧失合成和解毒功能导致黄疸,肝性脑病,凝血障碍,和多器官衰竭[2]严重威胁患者的生命。而血氨(blood ammonia,BA)升高在肝脏衰竭时较为常见,在近年来的临床实践中,其对肝脏代谢能力的指示作用受到越拉越多的关注,血氨不仅对肝性脑病有诊断价值,其更能反应出肝脏病变的严重程度。血氨其在人体中的主要来源主要有肠道分解产生、肾脏分泌产生以及肌肉产氨,是人体内正常的代谢产物,人体中血氨的正常值为18~72umol/L[3]。肝脏是氨最为主要的代谢场所,正常情况下人体内的氨主要在肝脏中通过尿素循环的途径被合成尿素,而后随尿液经肾脏排出体外。而血氨在脑组织、心肌以及骨髂肌中则是由谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺,而后生成的谷氨酰胺随血液循环进入到肝脏,经由谷氨酰胺酶分解再次产生氨,最后,被分解出来的氨在肝细胞中参与尿素合成的鸟氨酸循环。而谷氨酰胺在肝细胞液内也可经由CPSII途径参与嘧啶的从头合成,是细胞内DNA及RNA合成的基本原料。当肝脏由于病变受到损伤时,将会影响肝脏本身的代谢能力,使其无法有效地将人体内产生的氨代谢出去,从而导致氨在体内不断蓄积,氨对人体有很大的毒性作用,如不能及时将其转化为无毒或者毒性较小的产物代谢出去将会进一步加重肝脏损伤,出现更严重的并发症(如肝性脑病),甚至诱发肝衰竭。而肝衰竭发生后,肝细胞大量的坏死和凋亡,细胞正常的功能严重受损,但“残存”的肝细胞无法通过代偿来满足人体正常的需要从而导致一系列的功能紊乱,包括血氨升高,出现乳酸酸中毒,糖代谢紊乱以及吲哚水平升高等。而氨在体内蓄积后对机体产生的影响,主要体现在以下几个方面:①氨可以引起体内星形胶质细胞发生肿胀;研究发现,星形胶质细胞肿胀是急性肝衰竭时脑水肿发生的重要的病理指标。②氨能够引起线粒体的通透性发生转换。③氨同样可以引起细胞能量代谢出现障碍。④由氨引起的氧化应激效应[4-6]。既往对高血氨的研究主要着眼于氨对神经细胞的毒性作用,即肝性脑病的研究,目前关于肝性脑病的发病机制研究主要有:氨中毒学说、血浆中的氨基酸代谢学说、假性递质学说等,以及多种毒素在体内共同作用,相互影响,互为因果,共同促进感性脑病的发生和进展[7、8]。其中围绕氨中毒这一学说进行的研究最多。在脑组织中血氨主要依靠星形胶质细胞内部的谷氨酰胺合成酶来完成代谢,然而星形胶质细胞也是氨产生神经毒性主要的靶细胞,氨可以通过通过多种途径引起脑水肿并改变基因表达,最终的结果是神经元失去了星形胶质细胞的营养支持作用,从而引发肝性脑病。通过临床实践我们发现,在以“二次打击学说”为基础,给予相同的抗病毒、保肝、利尿等基础治的同时,采用全程门冬氨酸鸟氨酸治疗可以明显延缓乙肝相关慢加急性肝衰竭的病情进展[9],通过降低患者体内血氨水平明显缓解了肝脏损伤,极大的促进了肝细胞的分泌、解毒、合成及转化等功能,能够降低病死率,改善患者预后。而随着降血氨药物的应用,患者血清胆红素水平也随之下降,二者之间有相关性。随后进行的动物实验也证实,使用氯化铵对大鼠进行灌胃处理构建高血氨模型后,能够观察到血氨可以直接通过肝细胞凋亡诱导肝损伤,其机制可能是通过影响基因的表达来介导的[10]。同样用氯化铵处理人正常肝细胞后可以发现氯化铵可以明显抑制正常肝细胞的生长。进一步的实验表明,氨可以通过干扰正常肝细胞内的能量代谢来干扰胆红素的代谢过程[11]。代谢组学研究表明氯化铵处理后的肝细胞内的谷氨酰胺水平增加,而细胞内RNA合成的却受到抑制,合成原料增加而产物却减少,进一步的结果表明作为嘧啶从头合成的重要中间产物乳清酸的合成也受到抑制,这可能是RNA合成受到抑制的关键所在,但具体的机制尚不明确,我们推测可能是氯化铵抑制了能够催化合成乳清酸的二氢乳清酸脱氢酶。因此我们希望通过实验来探明这一现象出现的原因,有助于我们深层次的认识肝衰竭的发生机制,为肝衰竭的治疗提供新的理论基础。目的检验氯化铵处理人正常肝细胞后,细胞的生长状态以及与乳清酸合成有关的二氢乳清酸脱氢酶表达发生的变化。方法1.培养人正常肝细胞系(changliver),给予NH4CL(1.25、2.5、5、1 O、20、40和80mmol/L)刺激细胞12、24、48小时后,CCK8法检测细胞的增殖情况。2.流式细胞仪检测经5、10、20 mmol/L的NH4Cl刺激24小时后changliver细胞凋亡情况。3.Realtime-PCR方法检测经5、10、20 mmol/L的NH4Cl刺激12、24、48小时后细胞内二氢乳清酸脱氢酶m RNA的表达。4.Western-blotting方法检测经5、10、20 mmol/L的NH4CL刺激12、24、48小时后细胞内二氢乳清酸脱氢酶蛋白的表达。5.采用SPSS17.0统计软件对数据结果进行处理,定量资料采用均数±标准差(`x±s)来表示;数据呈正态分布的两组之间的比较采用t检验;数据呈正态分布的多组之间的比较采用方差分析;分类资料用R×C列联表χ2检验或Fisher精确概率检验;检验水准α=0.05。结果1.CCK-8结果示NH4CL能够抑制changliver细胞的增殖,且随着NH4CL浓度的增加,其对changliver细胞增殖的抑制率逐渐增加。2.流式细胞仪检测结果表明,在5、10、20 mmol/L的NH4CL浓度梯度下刺激24小时后,changliver细胞出现明显的凋亡现象,且NH4CL浓度越高,凋亡越明显。3.Realtime-PCR结果表明,在5、10、20 mmol/L的NH4CL浓度梯度下刺激12、24、48小时后,细胞内二氢乳清酸脱氢酶m RNA表达量较对照组明显减少(p0.05);4.Western-blot结果表明在5、10、20 mmol/L的NH4CL浓度梯度下刺激12、24、48小时后,细胞内二氢乳清酸脱氢酶蛋白的表达量较对照组明显减少(p0.05);结论1.NH4CL能够抑制changliver细胞的增殖,且随着NH4CL浓度的增加,其对changliver细胞增殖的抑制率逐渐增加。2.NH4CL能够引起changliver细胞发生凋亡,且随着NH4CL浓度的增加,凋亡越明显。3.NH4CL能够抑制changliver细胞中的二氢乳清酸脱氢酶的表达进而导致乳清酸合成减少,干扰嘧啶核苷酸的合成。
【关键词】：氯化铵 人肝细胞 二氢乳清酸脱氢酶
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R333.4
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 英文缩略词13-15
• 前言15-19
• 材料与方法19-29
• 实验结果29-33
• 讨论33-39
• 参考文献39-43
• 综述 二氢乳清酸脱氢酶的相关研究进展43-58
• 参考文献54-58
• 致谢58-59
• 个人简历59-60
• 科研成果60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 李晓光;于永光;王丽艳;郭欣;王连明;;血氨检测在临床肝脏疾病中的应用价值[J];国际检验医学杂志;2012年11期

2 王立鹏;陈晓;高峻;;肝性脑病中氧化应激参与氨中毒的研究进展[J];国际消化病杂志;2011年02期

3 关克磊;阚全程;余祖江;李晶晶;司方莹;申s

本文编号：312312