FGFR3单链抗体和FGFR3单链抗体—鱼精蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及功能研究

发布时间：2017-04-17 14:17

本文关键词：FGFR3单链抗体和FGFR3单链抗体—鱼精蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor3, FGFR3）是FGFR家族的一员，与成纤维细胞因子特异性结合后，在细胞的增殖分化过程中发挥重要的调节作用。近年来，越来越多文献报道FGFR3的突变或过表达与多种肿瘤的发生发展有着密切的联系。因此，FGFR3作为一个潜在的治疗肿瘤的靶点受到越来越多的关注，并且已经有靶向FGFR3的药物被成功研制并进入二期临床实验。本课题中，我们设计了两种蛋白：抗FGFR3的单链抗体（single chain fragment variable，ScFv）和ScFv与截短型鱼精蛋白（truncated protamine，tp）的融合蛋白ScFv-tp。希望达到以下两个目的：一、ScFv特异性结合FGFR3，并发挥生物学作用，拮抗FGFR3的磷酸化；二、融合蛋白ScFv-tp中，ScFv能够特异性的结合FGFR3，是“定位装置”，tp在中性条件下带正电，能与带负电的核酸结合，是“携带装置”，用ScFv-tp将有生物学功能的siRNA（“杀伤装置”）靶向运送至FGFR3+肿瘤细胞内，从而通过RNAi机制沉默相关基因，为FGFR3+肿瘤的靶向治疗提供一种有效的方法。通过PCR扩增将ScFv与小泛素修饰复合物（Small ubiquitin-related modifierProteins，Sumo）分子伴侣连接，构建表达载体pET-20b-Sumo-ScFv，并在大肠杆菌内表达。经Ni柱亲和层析纯化、Sumo酶切和再纯化，获得抗FGFR3的单链抗体ScFv，蛋白纯度达到90%以上，产量可达到约4mg每升菌液。细胞实验结果表明ScFv能够特异性结合FGFR3，并抑制FGF9对FGFR3的磷酸化作用。利用相同方法构建融合蛋白ScFv-tp的表达载体pET-20b-Sumo-ScFv-tp，但获得的融合蛋白ScFv-tp结合了过多菌体本身破碎时释放的基因组DNA，影响后续实验中siRNA的携带。为避免融合蛋白结合菌体DNA，我们采用了包涵体表达的策略。首先将Sumo去掉，构建了融合蛋白ScFv-tp的表达载体pET-20b-ScFv-tp，并在大肠杆菌中以包涵体形式表达。通过包涵体洗涤与变复性纯化蛋白，并获得重折叠的可溶性蛋白。蛋白纯度达到90%以上，产量可达到约10mg每升菌液。凝胶阻滞实验结果表明，所得的ScFv-tp不带有菌体DNA，而能够结合siRNA，且此种结合作用有饱和性。流式细胞术检测和免疫荧光检测证实ScFv-tp能够将siRNA运送至FGFR3+细胞K562和RT-112内，而不能运送至FGFR3-细胞THP-1内。RT-PCR和Western Blot实验结果表明通过ScFv-tp递送入RT-112细胞的siRNA在细胞内产生了明显的RNAi效应，干扰了乳腺癌扩增基因-1（amplified in breast cancer1，AIB1）的表达，使细胞中AIB1基因的mRNA和蛋白表达量明显减低。综上所述，本研究首先在大肠杆菌中可溶性表达并获得了靶向FGFR3的单链抗体ScFv，且ScFv特异性结合FGFR3后能够明显抑制FGF9诱导的FGFR3的磷酸化作用；其次通过包涵体变复性的方法获得了FGFR3的单链抗体ScFv与截短的鱼精蛋白tp的融合蛋白ScFv-tp，该融合蛋白不仅能够结合siRNA，而且能够靶向性地将其运送至FGFR3+细胞内，并有效地发挥RNAi效应将相关基因AIB1沉默。
【关键词】：成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3） 单链抗体（ScFv） 小分子干扰RNA（siRNA） 重组融合蛋白质 原核表达 蛋白纯化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R3411
【目录】：

摘要4-6
Abstract6-11
第一章绪论11-17
1.1 成纤维细胞生长因子（FGF）及成纤维细胞生长因子受体（FGFR）11-12
1.2 单链抗体12
1.3 siRNA 与癌症12-13
1.4 siRNA 的运输系统13-14
1.5 原核表达与 Sumo 表达系统14-15
1.6 课题设计思路15-17
第二章实验试剂、仪器及实验步骤17-24
2.1 主要试剂17-18
2.2 实验仪器18-19
2.3 实验室常用溶液19-21
2.3.1 SDS-PAGE 试剂19
2.3.2 Western blot 试剂19
2.3.3 细菌培养基19-20
2.3.4 50×Tris-乙酸（TAE）20
2.3.5 Amp（100 mg/mL）贮存液20
2.3.6 蛋白纯化相关缓冲液20-21
2.4 实验室基本方法21-24
2.4.1 DNA 片段胶回收21
2.4.2 重组子转化21
2.4.3 质粒提取21-24
第三章 ScFv 原核表达载体的构建及重组 ScFv 蛋白的诱导表达和纯化24-36
3.1 实验目的24
3.2 实验方法24-30
3.2.1 ScFv 表达载体的构建24-27
3.2.2 重组蛋白的表达与纯化27-30
3.3 实验结果30-35
3.3.1 Sumo 和 Sumo-ScFv 片段电泳结果30-31
3.3.2 重组质粒酶切与测序鉴定31
3.3.3 重组蛋白 Sumo-ScFv 的诱导表达及可溶性表达情况31-32
3.3.4 重组蛋白 Sumo-ScFv 的纯化32
3.3.5 重组蛋白 Sumo-ScFv 的 Western Blot 检测32-33
3.3.6 融合蛋白 Sumo-ScFv 酶切及纯化33
3.3.7 目的蛋白 ScFv 质谱测序33-34
3.3.8 目的蛋白 ScFv 抑制 FGF9 诱导的 FGFR3 磷酸化的研究34-35
3.4 实验小结35-36
第四章融合蛋白 ScFv-tp 的表达、纯化及功能研究36-49
4.1 实验方法36-42
4.1.1 重组质粒 pET-20b-ScFv-tp 表达载体的构建36
4.1.2 ScFv-tp 融合蛋白的表达与获得36-37
4.1.3 ScFv-tp 融合蛋白的鉴定37-38
4.1.4 ScFv-tp 融合蛋白结合 siRNA 能力的鉴定38
4.1.5 流式细胞术检测 ScFv-tp 运送 siRNA 入 K562 细胞的能力38
4.1.6 免疫荧光检测 ScFv-tp 运送 siRNA 入 RT-112 细胞的能力38-39
4.1.7 ScFv-tp 运送 siRNA 对 RT-112 细胞在 mRNA 水平的影响39-41
4.1.8 ScFv-tp 运送 siRNA 对 RT-112 细胞在蛋白水平的影响41-42
4.2 实验结果42-48
4.2.1 ScFv-tp 基因片段的 PCR 扩增42
4.2.2 融合蛋白 ScFv-tp 的诱导表达及可溶性表达情况42-43
4.2.3 包涵体蛋白的纯化与复性43
4.2.4 融合蛋白 ScFv-tp 的 Western Blot 鉴定43
4.2.5 ScFv-tp 融合蛋白的质谱鉴定43-44
4.2.6 ScFv-tp 融合蛋白结合 siRNA 的能力检测44
4.2.7 流式细胞术检测 ScFv-tp 运送 siRNA 入 K562 细胞的能力44-45
4.2.8 免疫荧光检测 ScFv-tp 运送 siRNA 入 RT-112 细胞的能力45-46
4.2.9 ScFv-tp 运送 siRNA 对 RT-112 细胞在 mRNA 水平的影响46-47
4.2.10 ScFv-tp 运送 siRNA 对 RT-112 细胞在蛋白水平的影响47-48
4.3 实验小结48-49
第五章讨论49-53
参考文献53-59
致谢59

【共引文献】

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1 姚海兰;肖宗慧;任红雁;韩继生;刘哲伟;;针对2B区域的短双链RNA抑制柯萨奇B3病毒感染HeLa细胞的特性研究[J];病毒学报;2007年04期

2 王斌;汤华;;病毒对抗RNAi的方式[J];医学分子生物学杂志;2007年01期

3 Orawan Khow;Sunutcha Suntrarachun;;Strategies for production of active eukaryotic proteins in bacterial expression system[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2012年02期

4 Brittany C.Parker;Wei Zhang;;Fusion genes in solid tumors: an emerging target for cancer diagnosis and treatment[J];Chinese Journal of Cancer;2013年11期

5 Lalit Patel;Brittany Parker;Da Yang;Wei Zhang;;Translational genomics in cancer research: converting profiles into personalized cancer medicine[J];Cancer Biology & Medicine;2013年04期

6 陈泉;扈进冬;赵晓燕;李哲;李纪顺;杨合同;;天蚕素AD和BuforinⅡ表达载体的改良和融合蛋白表达条件优化[J];福建农业学报;2013年12期

7 潘家茂;蓝健益;郑小群;秦秀林;冯家勋;刘君梁;;根癌农杆菌介导的绿色木霉HP35-3转化及表达体系的构建[J];基因组学与应用生物学;2014年04期

8 李广京;杨静美;叶滔;胡安龙;;抗菌肽基因异源表达系统研究进展[J];广东农业科学;2014年17期

9 申培力;骆文龙;;丝裂霉素C预防家兔喉气管狭窄的实验研究[J];第三军医大学学报;2014年24期

10 Jie Chen;Zi-xue Jiao;Lin Lin;Zhao-pei Guo;Cai-na Xu;Yan-hui Li;田华雨;Xue-si Chen;;Polylysine-modified Polyethylenimines as siRNA Carriers for Effective Tumor Treatment[J];Chinese Journal of Polymer Science;2015年06期

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1 昌磊;万特普安在膀胱癌中的抑癌效应及分子机制研究[D];华中科技大学;2013年

2 倪长伟;抗MRP3单链抗体与sTRAIL融合蛋白的克隆表达及其对多形性胶质母细胞瘤的靶向凋亡诱导作用研究[D];大连医科大学;2012年

3 郭旺明;重组大肠杆菌工业生产三种蛋白药物过程中的关键技术[D];浙江大学;2012年

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5 周霞;Fgfr2 S252W功能增强型突变对小鼠下颌骨及牙齿影响研究[D];第三军医大学;2013年

6 王崧;新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制备及其作用机制研究[D];第三军医大学;2013年

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