人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）cDNA的克隆和表达

发布时间：2021-05-11 09:08

　　用脂多糖（LPS）诱导人体外周血单核细胞产生hG-CSFmRNA和hG-CSF，诱导第4小时合成hG-CSFmRNA，第12小时培养介质中检测出hG-CSF，第24小时达高峰。用酸性钣-酚-氯仿法提取LPS诱导4小时的人单核细胞总RNA，然后用两个特异性引物通过RNA PCR技术扩增得到所需的G-CSFcDNA。在PCR反应中，使用了不同的退火温度，以选择PCR的最适条件，结果是当退火温度67℃时，扩增的特异性产物最多，非特异性产物最少。将扩增的G-CSFcDNA分别插入到质粒pUC18和分泌型表达载体中并转化受体菌。重组质粒经双酶切后进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选，并用斑点杂交和Southern blot方法作了鉴定，最后得到了4个全长cDNA的阳性克隆。插入hG-CSFcDNA的分泌型表达鼠体在大肠杆菌内经IPTO的诱导，表达出rhG-CSF，并分泌到细菌的周质部位。用双单抗夹心ELISA法检测IPTO诱导的重组体细菌的周质蛋白，其酶标反应读效显著高于未经IPTG诱导的重组体细菌和载体对照细菌。这证明我们已经克隆到了hG-CSFcDNA，并且成功地进行了表达。 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：52 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
一、题目：人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)cDNA的克隆和表达
二、摘要
三、前言
四、材料和方法
    (一) 材料
        1.实验试剂
        2.器材
    (二) 实验方法
        1.正常人外周血单核细胞的分离
        2.脂多糖(LPS)诱导外周血单核细胞
        3.酸性鈲盐—酚—氯仿法提取LPS诱导的单核细胞总RNA
        4.用特异性3’端引物逆转录合成G-CSFcDNA的第一条链
        5.用PCR技术扩增G-CSF mRNA的逆转录产物
        6.分泌型表达载体质粒的提取
        7.分泌型表达载体质粒和质粒pUC_(1(?))的酶切和去磷酸
        8.PCR产物(G-CSF cDNA)的磷酸化和纯化
        9.G-CSF cDNA的克隆及鉴定
        10.G-CSF cDNA的重组体在受体菌中的表达
        11.双单克隆抗体夹心ELISH法检测rhG-CSF
五、结果
    (一) 脂多糖诱导人外周血单核细胞产生G-CSF
    (二) 酸性鈲盐—酚—氯仿法提取LPS诱导的单核细胞总RNA
    (三) RNA PCR技术扩增G-CSF cDNA
    (四) 分泌型表达载体质粒的提取和酶切产物的鉴定
    (五) hG-CSF cDNA的克隆和鉴定
    (六) hG-CSF cDNA重组质粒在受体菌中的表达
六、讨论
    (一) LPS诱导人单核细胞产生G-CSF mRNA和G-CSF
    (二) 用RNA PCR技术扩增G-CSF cDNA
    (三) G-CSF cDNA的克隆和表达
    (四) 夹心ELISA法检测G-CSF
    (五) rhG-CSF的应用前景及进一步研究设想
七、参考文献
八、致谢
综述
Reference


【参考文献】：
期刊论文
[1]在大肠杆菌中分泌型表达人α心钠素衍生物[J]. 李磊,郭文彤,李光地,王健平,张迺蘅,李载平,曾桂超,汤健.  生物化学杂志. 1991(04)



本文编号：3181146