圆圃棘口吸虫分子种系发生的研究

发布时间：2017-04-20 12:10

  本文关键词：圆圃棘口吸虫分子种系发生的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：圆圃棘口吸虫(Echinostoma hortense)隶属于扁形动物门(Platyhelminthes)、吸虫纲(Trematoda)、复殖亚纲(Digenea)、棘口目(Echinostomata)、棘口科(Echinostomatidae)、棘口属(Echinostoma),是寄生于哺乳类等动物小肠内的吸虫。圆圃棘口吸虫的主要终末宿主有鼠、犬、猫以及猪。当感染圆圃棘口吸虫时会引起动物消瘦、贫血和营养障碍,严重者可以引起死亡。而且圆圃棘口吸虫也可以寄生于人,是一种重要的人兽共患病病原。圆圃棘口吸虫主要流行于韩国、日本、中国以及东南亚各国。目前对圆圃棘口吸虫的研究主要集中于传统寄生虫学方面,如形态学、生活史及疾病的流行病学调查、诊断和综合防治等;在分子水平上仅对核糖体ITS1以及线粒体cox1和nad1部分序列有所研究报道,而对核糖体其他基因和线粒体全基因组的研究还未见报道,因此,本研究针对这一空白展开研究。从自然感染病犬的小肠内采集虫体,经形态学鉴定为圆圃棘口吸虫。利用SDS-蛋白酶K法抽提圆圃棘口吸虫基因组DNA。首先,通过与GenBank上已发表的相关棘口目吸虫线粒体基因组序列比对,利用Oligo 7.3软件设计出7对特异性引物,PCR扩增线粒体各基因,序列拼接后对线粒体全基因组进行序列分析,构建系统发生树,探讨圆圃棘口吸虫在吸虫中的分子进化地位。然后再设计4对特异性引物,扩增5条圆圃棘口吸虫的核糖体18S、ITS1、5.8S、ITS2以及28S序列,运用分子生物学方法,对这5条圆圃棘口吸虫的5个序列的大小,碱基组成进行比对分析,并基于核糖体18S、ITS1序列构建系统发生树,分析圆圃棘口吸虫与其他吸虫间的进化关系。结果表明:所获得的圆圃棘口吸虫线粒体全基因组由22个tRNA基因、12个蛋白质编码基因、2个核糖体亚基基因和1个非编码区组成,大小为14,994 bp,编码蛋白质基因、核糖体亚基基因和非编码区序列长分别为10,047 bp,1,732bp和1,553 bp。整个线粒体基因组核苷酸组成为:T(41.69%)G(24.79%)A(21.36%)C(12.16%),AT含量为63.05%。圆圃棘口吸虫的基因排列(含核糖体大小亚基不含非编码区)属GO4型。以串联的12个蛋白质编码基因为基因标记,采用BI、MP和ML法构建系统发生树的结果相似,进化树分为二个大的分支,Clinostomoidea目平坦弯口吸虫(Clinostomum complanatum)独立成一进化分支,后睾目、棘口目和斜睾目为另一分支。圆圃棘口吸虫位于棘口目独立的进化分支上,说明线粒体全基因序列是研究寄生虫分子种系发生的良好基因标记。扩增获得的5条圆圃棘口吸虫的核糖体18S、ITS1、5.8S、ITS2以及28S序列,总长度均为为6,810 bp,且5条虫体18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S长度均未发生变化,分别为1,981 bp、444 bp、162 bp、440 bp和3,783 bp。比较发现5段基因的变异率分别为:0~0.1%、0~0.20%、0%、0~0.20%、0%。分别以核糖体18S和ITS1序列为标记基因,采用BI、MP和ML三种方法构建系统发生树的结果相似,进化树分为二个大的分支,枭形目为一独立进化分支,棘口目、后睾目和斜睾目为另一分支。圆圃棘口吸虫位于棘口目的进化分支上,与传统形态学分类一致,且与Isthmiophora hortensis在同一进化分支。表明核糖体18S和ITS1序列是研究寄生虫分子种系发生的良好基因标记。本研究首次获得了圆圃棘口吸虫线粒体全基因组,对线粒体基因组及核糖体18S、ITS1、5.8S、ITS2、28S进行了分析,并基于线粒体12个蛋白质编码基因和核糖体18S、ITS1序列构建系统发生树从分子水平上探讨了圆圃棘口吸虫与其他吸虫的进化关系。本研究丰富了吸虫线粒体、核糖体基因资料,为进一步研究棘口吸虫的分类、系统发生及圆圃棘口吸虫的起源奠定了基础。
【关键词】：圆圃棘口吸虫 线粒体全基因组 核糖体18S 核糖体ITS1 进化分析
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R383.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-38
• 1.1 圆圃棘口吸虫及圆圃棘口吸虫病12-16
• 1.1.1 病原形态13-14
• 1.1.2 生活史14
• 1.1.3 流行病学14-15
• 1.1.4 圆圃棘口吸虫病的症状及危害15-16
• 1.1.5 圆圃棘口吸虫病的防控16
• 1.2 吸虫线粒体基因组研究进展16-27
• 1.2.1 吸虫线粒体基因组全序列测定完成概况17-19
• 1.2.2 吸虫线粒体基因组的特点19-27
• 1.3 吸虫核糖体DNA研究进展27-35
• 1.3.1 吸虫核糖体DNA内转录间隔区（ITS）的研究进展28-32
• 1.3.2 吸虫 18S、28S核糖体序列的研究进展32-35
• 1.4 线粒体基因组和核糖体序列的用途35-36
• 1.5 研究的目的与意义36-38
• 第二章 圆圃棘口吸虫线粒体全基因组扩增与进化分析38-64
• 2.1 材料与方法38-46
• 2.1.1 材料38-39
• 2.1.2 方法39-46
• 2.2 圆圃棘口吸虫线粒体全基因组各段基因扩增与拼接46-49
• 2.2.1 圆圃棘口吸虫EHM-1 基因序列PCR结果46
• 2.2.2 圆圃棘口吸虫EHM-2 基因序列PCR结果46-47
• 2.2.3 圆圃棘口吸虫EHM-3 基因序列PCR结果47
• 2.2.4 圆圃棘口吸虫EHM-4 基因序列PCR结果47
• 2.2.5 圆圃棘口吸虫EHM-5 基因序列PCR结果47-48
• 2.2.6 圆圃棘口吸虫EHM-6 基因序列PCR结果48
• 2.2.7 圆圃棘口吸虫EHM-7 基因序列PCR结果48-49
• 2.2.8 圆圃棘口吸虫线粒体基因序列拼接49
• 2.3 圆圃棘口吸虫线粒体分析49-56
• 2.3.1 圆圃棘口吸虫线粒体全基因组的特征49-53
• 2.3.2 圆圃棘口吸虫线粒体中基因的排列顺序和密码子的使用53-55
• 2.3.3 圆圃棘口吸虫线粒体中的tRNA和rrnA55-56
• 2.3.4 圆圃棘口吸虫线粒体的非编码区56
• 2.3.5 进化分析56
• 2.4 讨论56-64
• 2.4.1 圆圃棘口吸虫线粒体结构特点56-58
• 2.4.2 圆圃棘口吸虫线粒体蛋白质编码基因58-59
• 2.4.3 圆圃棘口吸虫线粒体密码子的使用59
• 2.4.4 圆圃棘口吸虫线粒体中RNA的分析59-60
• 2.4.5 圆圃棘口吸虫非编码区60-61
• 2.4.6 系统进化分析61-64
• 第三章 圆圃棘口吸虫核糖体序列的扩增与进化分析64-80
• 3.1 材料与方法64-67
• 3.1.1 材料64
• 3.1.2 方法64-67
• 3.2 圆圃棘口吸虫核糖体各部分PCR结果与拼接67-69
• 3.2.1 圆圃棘口吸虫EHR-1 基因序列PCR结果67
• 3.2.2 圆圃棘口吸虫EHR-2 基因序列PCR结果67
• 3.2.3 圆圃棘口吸虫EHR-3 基因序列PCR结果67-68
• 3.2.4 圆圃棘口吸虫EHR-4 基因序列PCR结果68-69
• 3.2.5 圆圃棘口吸虫核糖体基因序列拼接69
• 3.3 圆圃棘口吸虫核糖体分析69-75
• 3.3.1 圆圃棘口吸虫核糖体序列分析69-72
• 3.3.2 基于圆圃棘口吸虫核糖体 18S和ITS1序列构建进化树72-75
• 3.4 讨论75-80
• 3.4.1 圆圃棘口吸虫核糖体的结构特征75-76
• 3.4.2 基于核糖体 18S、ITS1构建的系统发生树76-80
• 第四章 结论80-82
• 附录82-86
• 附录 182-84
• 附录 284-86
• 参考文献86-98
• 致谢98-100
• 个人简历100-101

【参考文献】

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本文编号：318664