柯萨奇病毒B组5型VP1蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

发布时间：2021-07-26 19:04

　　目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR（RT-PCR）扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。 

【文章来源】：中国免疫学杂志. 2019,35(04)北大核心CSCD

【文章页数】：4 页

【部分图文】：

VP1片段扩增及重组载体的验证Fig．1AmplificationofVP1fragmentandverificationof

图4抗体对CVA16和EV71的交叉识别能力Fig．4CrossrecognitionabilityofantibodytoCVA16andEV71图5抗体识别脑组织CVB5抗原的免疫组化染色结果(×200)Fig．5ImmunohistochemicalstainingresultsofCVB5an-tigenidentifiedbyantibodyinbraintissue(×200)阴性血清做对照。图5A为对照组片子，其中没有棕色颗粒物，而实验组中则有明显的棕色颗粒，即图5B中箭头所指示，表明制得的抗体可用于免疫组化实验。3讨论近年来CVB5在世界范围内开始流行，如2006年在法国有23%的脑膜炎患者确定为CVB5感染［7］;在2003年至2004年，希腊也报道了CVB5引起的无菌性脑膜炎的流行［8］;在2005年和2009年，我国山东和河南也爆发了CVB5感染引发的无菌性脑膜炎［9］。虽然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但脑膜炎的疾病是有后遗症的。因此，CVB5的抗病毒药物及疫苗的研究和快速的临床诊断是非常迫切的。疫苗研究及临床诊断都需要用特异性抗体来检测病毒抗原。Opanda等［10］的研究表明，CVB5病毒颗粒的主要中和抗原表位位于VP1区。综上，本研究将目标瞄向了CVB5衣壳亚单位VP1蛋白多克隆抗体的制备。本实验成功构建了CVB5VP1基因的原核表达载体VP1-pET-28a，并将其在BL21细胞中大量诱导表达。重组VP1蛋白C、N两端都有His标签，因此我们利用HisTrapHP亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。纯化后的目的蛋白纯度大于90%，符合多克隆抗体制备的要求。纯化后的目的蛋白与弗氏佐剂混合后，分多次、多位点皮下注射免疫SD大鼠，获得了VP1

图4抗体对CVA16和EV71的交叉识别能力Fig．4CrossrecognitionabilityofantibodytoCVA16andEV71图5抗体识别脑组织CVB5抗原的免疫组化染色结果(×200)Fig．5ImmunohistochemicalstainingresultsofCVB5an-tigenidentifiedbyantibodyinbraintissue(×200)阴性血清做对照。图5A为对照组片子，其中没有棕色颗粒物，而实验组中则有明显的棕色颗粒，即图5B中箭头所指示，表明制得的抗体可用于免疫组化实验。3讨论近年来CVB5在世界范围内开始流行，如2006年在法国有23%的脑膜炎患者确定为CVB5感染［7］;在2003年至2004年，希腊也报道了CVB5引起的无菌性脑膜炎的流行［8］;在2005年和2009年，我国山东和河南也爆发了CVB5感染引发的无菌性脑膜炎［9］。虽然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但脑膜炎的疾病是有后遗症的。因此，CVB5的抗病毒药物及疫苗的研究和快速的临床诊断是非常迫切的。疫苗研究及临床诊断都需要用特异性抗体来检测病毒抗原。Opanda等［10］的研究表明，CVB5病毒颗粒的主要中和抗原表位位于VP1区。综上，本研究将目标瞄向了CVB5衣壳亚单位VP1蛋白多克隆抗体的制备。本实验成功构建了CVB5VP1基因的原核表达载体VP1-pET-28a，并将其在BL21细胞中大量诱导表达。重组VP1蛋白C、N两端都有His标签，因此我们利用HisTrapHP亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。纯化后的目的蛋白纯度大于90%，符合多克隆抗体制备的要求。纯化后的目的蛋白与弗氏佐剂混合后，分多次、多位点皮下注射免疫SD大鼠，获得了VP1

【参考文献】：
期刊论文
[1]诺如病毒NV衣壳蛋白VP1表达纯化及多克隆抗体的制备[J]. 仉秋实,苑荣亮,井申荣.  中国微生态学杂志. 2017(08)
[2]Etiology, pathogenesis, antivirals and vaccines of hand,foot, and mouth disease[J]. Xiaobo Lei,Sheng Cui,Zhendong Zhao,Jianwei Wang.  National Science Review. 2015(03)



本文编号：3304173