猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究

发布时间：2017-04-28 21:13

  本文关键词：猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 目前体外分化的人呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell, HAEC)已被广泛应用于新发呼吸道病毒的鉴定、宿主与呼吸道病原体间相互作用和呼吸系统疾病的研究中。猪是许多人呼吸道病毒感染的天然宿主,在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都与人类有相似之处,因此猪可作为研究呼吸道病毒感染和呼吸系统疾病药物筛选的理想模型。目的构建猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell, PAEC)体外分化模型,鉴定其形态学和生理学特征及其在转导外源基因方面的应用。方法本研究采用蛋白酶低温消化分离猪气管和支气管上皮细胞,接种至I/III型胶原蛋白包被的细胞培养皿中,使用添加多种细胞生长因子的无血清培养基进行原代培养。细胞接种至IV型胶原蛋白包被的半透膜支持物上,采用气液界面培养法进行猪呼吸道上皮细胞的体外分化培养。采用扫描电镜法、电生理和免疫组化等方法检测和鉴定培养物的细胞组成和形态学特性以及其表面典型的细胞标志蛋白。腺相关病毒(Adenoassociated virus, AAV)具有免疫原性低和可介导外源基因长期表达的特性,在基因治疗领域有广阔的应用空间。本实验研究中将pXX680, pXR6, PSC-GFP三种质粒按照6：5：3的比例转染至293T细胞,培养48h后,收获含重组腺相关病毒rAAV6-GFP的293T细胞。利用两步氯化铯梯度离心纯化重组rAAV6-GFP病毒并感染分化成熟的猪呼吸道上皮细胞,研究AAV6在该模型上的转导效率,验证AAV6能否有效地介导外源基因表达。结果结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,其顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底层细胞。PAEC模型的电生理学特性-上皮细胞跨膜电阻在一定时期内保持稳定,表明PAEC细胞间连接的形成和跨细胞间离子运输的平衡。本研究通过三质粒共转染法成功制备了重组腺相关病毒rAAV6-GFP,其能够通过顶端表面感染PAEC,有效地转导呼吸道上皮细胞。结论本文构建的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型能够模拟人呼吸道的生理学和形态学特征,为呼吸道病原体感染机制、呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。
【关键词】：猪呼吸道上皮细胞 气液界面培养 腺相关病毒
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R56;R-332
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表(ABBREVIATION INDEX)7-8
• 前言8-12
• 1 人呼吸道上皮细胞8
• 2 呼吸道模型的研究进展8-11
• 3 猪呼吸道模型11
• 4 研究目的与意义11-12
• 材料与方法12-34
• 1 实验材料12-17
• 2 实验方法17-34
• 结果34-40
• 1 猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立34-35
• 2 猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的鉴定35-37
• 3 重组腺相关病毒rAAV6-GFP的制备及定量37-39
• 4 AAV6可以有效地转导猪呼吸道上皮细胞39-40
• 讨论40-42
• 结论42-43
• 参考文献43-49
• 综述49-61
• 参考文献56-61
• 个人简历61-62
• 硕士阶段论文发表情况62-63
• 致谢63-64

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 张少丹;李武平;;呼吸道上皮细胞模型的研究进展[J];病毒学报;2015年03期

2 张少丹;刘红梅;刘忠;李武平;;猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究[J];病毒学报;2015年04期

3 田亮;穆秦;岳登;付塞琴;;猪流感病毒免疫应答反应的研究进展[J];中国猪业;2015年01期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 温世勇;17-β雌二醇调控绵羊输卵管上皮细胞β-防御素1基因表达过程中NF-κB信号通路的研究[D];内蒙古农业大学;2014年

2 纪笑英;Th2/Th17偏转微环境对人支气管上皮细胞重塑的作用及其机制研究[D];中南大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 刘大鹏;钙激活氯离子通道对哮喘气道杯状细胞凋亡与黏液高分泌的影响[D];第四军医大学;2013年

2 陈叶雨;鱼类β-防御素的生物学活性研究及其互作蛋白的筛选[D];中国农业科学院;2013年

3 李妍妍;四个新的鸽β-防御素抗新城疫病毒作用机制的初步研究[D];东北农业大学;2014年

  本文关键词：猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：333567