利用CRISPR/Cas9系统在Beta-TC-6细胞株中剔除Sidt2基因

发布时间：2021-08-12 12:30

　　目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和电穿孔技术,在小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞（Beta-TC-6）中剔除溶酶体膜蛋白Sidt2基因。方法:针对小鼠Sidt2基因设计向导RNA（sgRNA）,sgRNA退火合成双链后克隆到px459载体中。测序鉴定成功的重组质粒命名为px459-Sidt2并大量扩增。使用NEPA 21高效基因转染系统将px459-Sidt2重组质粒电转到Beta-TC-6细胞中,电转染48 h后使用嘌呤霉素加压进行阳性细胞筛选。阳性细胞扩增冻存,得到Sidt2基因剔除混合克隆细胞株,提取细胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法检测细胞株中Sidt2的敲除效果。结果:成功构建靶向小鼠Sidt2基因的px459重组质粒px45-Sidt2。使用NEPA 21高效基因转染系统电转Beta-TC-6的最佳电转参数为脉冲电压150 V,脉冲时间5 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数2次,电压衰减10%,电穿孔模式为正方向。与对照组细胞相比,嘌呤霉素加压筛选得到的Beta-TC-6阳性细胞中的Sidt蛋白表达缺失（P<0.05）,成功在小鼠胰岛素瘤胰... 

【文章来源】：皖南医学院学报. 2019,38(03)

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【部分图文】：

设置脉冲电压梯度加压筛选72h后的阳性细胞

*T7E1酶切开的条带;＊＊P＜0．05。图3T7E1酶及westernblot检测小鼠Sidt2基因的敲除效果3讨论CＲISPＲ/Cas9基因编辑系统成为继锌指蛋白(ZFPs)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEs)之后的第三代基因编辑技术［8－9］。与传统的基因编辑工具相比具有诸多的优点，首先CＲISPＲ/Cas9基因编辑系统适应性和操作性强，来自产脓链球菌和嗜热链球菌的Cas9由于PAM识别序列仅为2个碱基(GG)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点［8］。Cas9蛋白在目前测试过的几乎所有生物和细胞中均有活性，包括细菌、酵母、植物、鱼以及哺乳动物细胞［10－14］;其次，CＲISPＲ/Cas9基因编辑系统简单易学，目前已有多种成熟的CＲISPＲ/Cas9基因编辑系统质粒载体，常规的分子生物学实验室即可开展构建，只需要将长约25bp左右的sgＲNA双链连接到线性化的载体中，构建难度相对于常见的表达载体和报告基因载体小，构建完成的载体只需要通过菌落PCＲ或者测序即可鉴定，不必像构建表达载体那样担心长片段的碱基突变问题。但是CＲISPＲ/Cas9质粒需要表达的cas9蛋白相对于其他的载体偏大，一般常常在10kbp以上，转染细胞难度较大，尤其对于难转染细胞更是雪上加霜。虽然可以通过对成功转染的细胞表达的抗生素筛选或者荧光标记束进行筛选，但是转染效率低将对后续的筛选和单克隆培养造成很大的困难，并且cas9蛋白具有一定的细胞毒性［15］，后续的抗生素筛选和流式分选也会对转染成功的细胞产生影响。因此提高CＲISPＲ/Cas9质粒的转染效率是急需解决的问题。目前质粒转染主流的方法包括脂质体转染、阳


本文编号：3338321