水痘-带状疱疹病毒主要衣壳蛋白ORF40单克隆抗体的制备及初步应用

发布时间：2021-08-14 03:07

　　目的:制备抗水痘-带状疱疹病毒（VZV）主要衣壳蛋白ORF40的单克隆抗体,对该蛋白在VZV感染细胞内的表达、分布以及在VZV病毒颗粒中的包含情况进行初步探究。方法:设计并合成VZV ORF40多肽片段,偶联牛血清白蛋白后免疫小鼠,制备与筛选抗VZV ORF40单克隆抗体,使用获得的抗体通过Western blot和免疫荧光法对VZV感染细胞进行检测,并通过Western blot对纯化的VZV病毒颗粒进行检测。结果:获得VZV ORF40单克隆抗体10F2,该抗体可特异性识别VZV感染细胞表达的以及VZV病毒颗粒包含的ORF40蛋白;本研究应用该抗体确定了ORF40蛋白在VZV感染细胞中的核定位,并且发现ORF40蛋白在核周有点状聚集现象,在细胞质区域偶尔也能检测到ORF40蛋白的分布。结论:本研究筛选获得抗VZV ORF40的特异性单克隆抗体,为后续开展该蛋白在VZV感染与病毒颗粒组装过程中的功能研究奠定基础。 

【文章来源】：中国免疫学杂志. 2019,35(09)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

抗VZV-OＲF40单克隆抗体10F2性质鉴定Fig．1Characterizationofanti-VZV-OＲF40mAb10F2

图2OＲF40在VZV感染细胞中的表达与亚细胞定位Fig．2ExpressionandsubcellularlocalizationofOＲF40inVZV-infectedcellsNote:A.WesternblotofcellextractsofAＲPE-19cellsuninfectedorinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2.1.UninfectedAＲPE-19cells;2.AＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOka.B.ImmunofluorescenceanalysisofAＲPE-19cellsuninfectedorinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2.2.2VZV感染细胞中OＲF40的Westernblot及免疫荧光检测收集VZVpOka感染48h后的AＲPE-19细胞及未感染的AＲPE-19阴性细胞，分别裂解后使用单抗10F2对其进行Westernblot检测。结果显示，单抗10F2与VZVpOka感染的AＲPE-19细胞裂解液发生特异性反应，且不与未感染的AＲPE-19细胞发生反应，其检出的蛋白条带在130～180kD之间，约为153kD(图2A)，与质粒转染表达的OＲF40蛋白(图1A)以及理论大小一致。进一步使用单抗10F2对VZVpOka感染48h后的AＲPE-19细胞及未感染的AＲPE-19阴性细胞做免疫荧光检测。结果显示，单抗10F2同样与VZV感染的AＲPE-19细胞发生较强的特异性反应，且发现与单独外源表达的OＲF40细胞质定位不同，本实验检出的OＲF40蛋白绝大部分定位于细胞核内，呈弥散分布或者在核周呈点状分布(图2B，白色箭头)，部分细胞的细胞质内也能检测到OＲF40(图2B，绿色箭头)，这样的定位变化可能是由于OＲF40蛋白和其他病毒蛋白相互作用，共同参与细胞核内的衣壳组装而引起的。同时，单抗10F2与未感染的AＲPE-19细胞没有任何非特异性反应。2.3VZV衣壳中OＲF40蛋白的Westernblot检测为进一步探究单抗10F2是否可用于对VZV衣壳中OＲF40蛋白的检测，本研究通过蔗糖密度梯度离心法从VZV感染的AＲPE-19细胞中初步纯化获得VZV衣?

亩ㄎ槐浠?赡苁怯捎贠ＲF40蛋白和其他病毒蛋白相互作用，共同参与细胞核内的衣壳组装而引起的。同时，单抗10F2与未感染的AＲPE-19细胞没有任何非特异性反应。2.3VZV衣壳中OＲF40蛋白的Westernblot检测为进一步探究单抗10F2是否可用于对VZV衣壳中OＲF40蛋白的检测，本研究通过蔗糖密度梯度离心法从VZV感染的AＲPE-19细胞中初步纯化获得VZV衣壳颗粒，通过银染(图3A)和透射电镜(图3B)分析可见获得的VZV衣壳纯度较好。随后，通过Westernblot分析发现(图3C)，OＲF40蛋白与另一种小衣壳蛋白OＲF23均能在纯化的VZV衣壳中图310F2可用于VZV衣壳中OＲF40蛋白检测Fig．3DetectionofOＲF40containedinVZVcapsidsusingmAb10F2Note:A.SilverstaininganalysisofpurifiedVZVcapsidsandcellextractsofAＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2;B.TransmissionelectronmicroscopyofpurifiedVZVcapsids;C.WesternblotanalysisofpurifiedVZVcapsidsandcellextractsofAＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2.1.PurifiedVZVcapsids;2.AＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOka;M.Proteinmarker.检出，且无法检出病毒囊膜蛋白(如gE)，也基本不包含细胞成分(如β-tubulin)，而以上蛋白在VZV感染细胞裂解液中均能检出。该结果证明，单抗10F2对VZV衣壳中OＲF40蛋白同样具有高效且特异的识别能力。3讨论VZV的有效扩散依赖于大量感染性病毒颗粒的产生，而高度有序的病毒衣壳蛋白元件的合成与衣壳组装是VZV感染与制周期的关键步骤，为设计抗病毒药物提供了良好靶标。虽然通过HSV-1的同源推测已经大致确定了VZV衣壳蛋白的种类及功能，但是关于VZV衣壳蛋白的性质、功能、蛋白-蛋白相互作用及其组装机制仍缺少研究报


本文编号：3341646