巨噬细胞特异性敲除Cdc42基因加重细菌脂多糖LPS诱导的小鼠炎症反应

发布时间：2017-04-29 08:01

  本文关键词：巨噬细胞特异性敲除Cdc42基因加重细菌脂多糖LPS诱导的小鼠炎症反应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:炎症反应是机体对于外界刺激的一种防御反应,即机体对损伤因子引起的局部或全身发生的一系列复杂的免疫应答过程。炎症反应参与了肥胖、动脉粥样硬化等多种代谢性疾病和心血管疾病的病理进程。巨噬细胞作为重要的先天免疫防御细胞介导和参与了机体各个器官与组织中炎症反应。细胞分裂周期蛋白42(Cdc42蛋白)是Rho家族蛋白重要成员之一,Cdc42通过与GTP结合的活化状态或与GDP结合的非活化状态发挥分子开关的作用。活化的Cdc42通过PAKs、MRCKs、MLKs等多种激酶的调控进一步调节细胞极性,细胞骨架重构,增殖,迁移,粘附等生理过程。虽然Cdc42对炎症反应的影响已有一些研究,但巨噬细胞特异性敲除Cdc42基因对炎症反应的影响还未见相关报道。本文旨在探讨巨噬细胞缺失Cdc42对细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的炎症反应的影响及其分子机制。方法与结果:1.特异性敲除巨噬细胞Cdc42小鼠的制备及鉴定:本研究利用Cdc42/FLOX小鼠与lyz-cre小鼠杂交制备特异性敲除巨噬细胞Cdc42小鼠。PCR结果显示,已成功制备特异性敲除巨噬细胞Cdc42小鼠,Western Blot结果显示基因敲除小鼠巨噬细胞Cdc42蛋白被敲除达90%。2.LPS诱导小鼠休克模型的制备及其检测:腹腔注射脂多糖LPS(20mg/kg)于特异性敲除巨噬细胞Cdc42小鼠和对照组小鼠,观察小鼠死亡情况,绘制死亡曲线,HE染色观察肝、肾、肺、脾器官的损伤情况。同时检测小鼠的血常规。结果显示,LPS诱导巨噬细胞特异性缺失Cdc42小鼠的死亡率明显增加,至给药后第108小时实验组与对照组死亡率分别为77.8%与44.4%。小鼠腹腔注射LPS 6h后,巨噬细胞特异性缺失Cdc42小鼠的肝、肺、肾、脾损伤更为严重,脾脏与体重比明显高于对照组。血常规检测表明,Cdc42特异性缺失小鼠白细胞与淋巴细胞数目显著性高于对照组小鼠。3.Cdc42缺失对LPS诱导小鼠巨噬细胞细胞因子释放的影响:每只小鼠腹腔注射4%硫胶质溶液3-4m L,5天后收集腹腔巨噬细胞。小鼠腹腔巨噬细胞,采用100 ng/ml的LPS刺激12小时后QPCR检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的表达情况,并在细胞水平上对相关的信号通路进行研究。结果显示,LPS刺激原代巨噬细胞12h,Cdc42特异性缺失小鼠巨噬细胞炎症因子表达量显著高于对照组。LPS刺激原代巨噬细胞16h,Cdc42特异性缺失小鼠巨噬细胞P-P38、P-NF-κB蛋白表达量高于对照组,P-ERK、P-PI3K、P-AKT蛋白的表达量低于对照组。结论:1.特异性敲除巨噬细胞Cdc42基因可显著加重小鼠对LPS诱导炎症反应的损伤。2.特异性敲除巨噬细胞Cdc42小鼠加重对LPS诱导炎症反应的作用可能与激活CDC42缺失巨噬细胞的P38及NF-κB信号通路有关。
【关键词】：Cdc42蛋白 巨噬细胞 细菌脂多糖 细胞因子 MAPK信号转导通路
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R364.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 中英文缩略词10-11
• 第1章 绪论11-15
• 1.1 Cdc42的研究进展11-12
• 1.2 巨噬细胞与炎症反应12-14
• 1.2.1 炎症反应12-13
• 1.2.2 巨噬细胞在炎症反应过程中的作用13-14
• 1.3 Cdc42在炎症反应中的作用及其研究进展14
• 1.4 本研究的目的及意义14
• 1.5 数据统计分析14-15
• 第2章 敲除小鼠巨噬细胞Cdc42对LPS引起的炎症反应的影响15-26
• 2.1 引言15
• 2.2 实验材料和方法15-22
• 2.2.1 实验动物15
• 2.2.2 Cdc42特异性敲除小鼠的制备15-18
• 2.2.3 原代腹腔巨噬细胞的提取及培养18-19
• 2.2.4 巨噬细胞炎症因子的表达19-21
• 2.2.5 巨噬细胞Cdc42敲除在蛋白水平的鉴定21-22
• 2.3 实验结果22-26
• 2.3.1 Cdc42基因敲除小鼠基因型鉴定结果22-23
• 2.3.2 巨噬细胞敲除Cdc42蛋白水平的鉴定结果23-24
• 2.3.3 特异性敲除巨噬细胞CDC42对LPS刺激诱导炎性细胞因子的影响24-26
• 第3章 巨噬细胞Cdc42敲除小鼠对LPS引起的全身炎症反应综合征的影响26-35
• 3.1 引言26
• 3.2 材料与方法26-28
• 3.2.1 内毒素休克实验26-27
• 3.2.2 LPS致使多器官损伤观察27-28
• 3.2.3 小鼠血常规分析28
• 3.3 实验结果28-35
• 3.3.1 内毒素休克实验小鼠死亡率28-29
• 3.3.2 小鼠脾脏体重比29-31
• 3.3.3 HE染色结果31-34
• 3.3.4 小鼠血常规分析34-35
• 第4章 Cdc42缺失在炎症反应中的作用及其分子机制35-45
• 4.1 引言35-38
• 4.2 实验方法与材料38-41
• 4.2.1 腹腔原代巨噬细胞蛋白的提取38-39
• 4.2.2 免疫印记实验39-41
• 4.3 实验结果41-45
• 4.3.1 检测巨噬细胞中P38、NF-κB的表达和磷酸化41-42
• 4.3.2 检测巨噬细胞中ERK的表达及其磷酸化42-43
• 4.3.3 检测巨噬细胞中PI3K、AKT等相关蛋白的表达及其磷酸化43-45
• 第5章 讨论45-47
• 第6章 结论与展望47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-52
• 综述52-56
• 参考文献55-56

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