HSP65-PEAⅠ融合蛋白表达纯化及免疫效果研究

发布时间：2017-05-01 05:07

  本文关键词：HSP65-PEAⅠ融合蛋白表达纯化及免疫效果研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：绿脓杆菌是极受关注的条件致病菌,在食品中毒素残留引起的食物中毒事件越来越多,其具有多重耐药性,免疫预防绿脓杆菌中毒成为了研究的热点。同时,绿脓杆菌也是烧烫伤表面感染的主要致病菌。其主要致病因子为绿脓杆菌外毒素A(PEA),PEA通过受体结合亚基与细胞表面受体相结合,毒性部分越膜亚基运输到细胞内,催化EF-2的核糖基化抑制蛋白合成使靶细胞死亡。热休克蛋白65(HSP65)是主要的分子伴侣家族之一,参与蛋白质的折叠,防止蛋白变性聚集,促进变性蛋白解聚进行重折叠,维护细胞结构与功能。本研究采用基因工程手段,将PEA受体结合亚基(PEAⅠ)与热休克蛋白65进行融合表达,研制一种抗绿脓杆菌毒素侵袭的有效疫苗。该疫苗不仅具有PEA的高度保守性和免疫原性,还具有热休克蛋白增强免疫的特点。进一步为防治食源性绿脓杆菌感染、抗烧烫伤病人多器官衰竭的研究奠定了基础。利用基因工程手段将HSP65-PEAⅠ基因片段经HindⅢ和NotⅠ双酶切后连接到pET-28a载体中,构建重组表达质粒pET-28a-HHP,导入感受态E.coli BL21(DE3)细胞,获得表达菌E.coliBL21(DE3)(pET-28a-HHP),经诱导表达重组蛋白HHP,摸索纯化工艺获得最佳纯化条件,最终得到纯度为90%的HHP纯品。以HHP为免疫原,建立小鼠免疫试验模型,检测抗体效价水平,初步评价免疫效果。优化并确定最佳免疫程序,为建立烧烫伤感染多器官衰竭动物模型免疫保护实验奠定基础。重组表达质粒pET-28a-HHP,经PCR和双酶切鉴定正确后,测序结果显示:基因片段HSP65-PEAⅠ正确克隆到pET-28a载体中,表达的重组蛋白相对分子质量约为97000Da,以包涵体形式表达,对包涵体洗涤、变性以及复性工艺进行优化后,最佳的条件为:2%TritonX-100和2M Urea依次洗涤,8M Urea变性裂解,逐步透析至尿素的终浓度为0.5M完成复性。可溶形式蛋白HHP进一步纯化工艺为:样品经Q阴离子交换层析---SephadexTM G-25 Fine层析---金属螯合层析(Cu2+),获得浓度为0.5 mg/mL,纯度达90%以上的HHP。在用HHP蛋白对小鼠免疫的一周后检测到特异性抗体,抗体效价水平持续增长且在42天均达到了1:210以上,其中铝盐佐剂组产生的抗体滴度最高。免疫动物攻毒保护实验结果显示:铝盐佐剂组攻毒保护率最高,对3×LD50剂量毒素保护率高达100%,对5×LD50剂量毒素保护率为80%。最终确定最佳免疫程序为:免疫制剂为20μgHHP蛋白与铝盐佐剂1:1(v:v)混合,免疫的第49d抗体滴度达到1:212,对实验鼠进行PEA攻毒,能够耐受3×LD50攻毒剂量,对5×LD50攻毒保护率高于80%。在本研究中,成功改造后的重组表达质粒pET-28a-HHP在大肠杆菌中高效表达蛋白HHP,具有组氨酸标签,纯化工艺流程简单,耗时短,纯度高,适用于中试规模进行生产。制备的抗PEA免疫制剂表现出较强的免疫原性,能够保护机体耐受毒素攻击,为治疗与预防绿脓杆菌食物中毒、进一步发开应用于临床的抗绿脓杆菌感染的免疫制剂奠定坚实基础。
【关键词】：绿脓杆菌外毒素A 热休克蛋白65 纯化 免疫程序
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-19
• 1.1 绿脓杆菌研究概述9-12
• 1.2 热休克蛋白研究概述12-18
• 1.3 研究内容18
• 1.4 研究目的与意义18
• 1.5 创新点18-19
• 2 材料与方法19-32
• 2.1 材料19-21
• 2.2 方法21-32
• 3 结果与分析32-41
• 3.1 鉴定重组表达质粒pET-28a-HHP32-33
• 3.2 重组蛋白HHP表达SDS-PAGE分析结果33
• 3.3 包涵体洗涤条件的优化33-34
• 3.4 Q SepharoseTM High Performance阴离子交换层析34
• 3.5 金属螯合层析（Cu2+）34-35
• 3.6 抗体效价测定结果35
• 3.7 动物攻毒剂量测定及LD50测定结果35-36
• 3.8 攻毒保护实验结果36-37
• 3.9 PEA经阴离子交换层析纯化结果37-38
• 3.10 Western blot检测纯化后的PEA38
• 3.11 抗原SEB-HSP65、PEA、HHP的抗体滴度比较结果38-39
• 3.12 优化后的免疫程序抗体效价测定结果39
• 3.13 优化后的免疫程序的攻毒保护实验结果39-41
• 4 讨论41-43
• 4.1 表达系统的选择41
• 4.2 洗涤包涵体条件的优化41
• 4.3 蛋白层析的选择41-42
• 4.4 抗原特异性的确定42
• 4.5 免疫程序的建立与优化42-43
• 5 结论43-45
• 5.1 成功构建重组质粒pET-28a-HHP43
• 5.2 确定最佳包涵体复性条件43
• 5.3 获得高纯度重组蛋白HHP43
• 5.4 免疫动物产生高滴度抗体43
• 5.5 免疫动物能够抵抗高剂量毒素攻击43-44
• 5.6 确定最佳免疫程序44-45
• 参考文献45-51
• 作者简介51-52
• 致谢52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈长征,段治军,杨新颖,夏其昌,李伯良,王应睐;T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统[J];生物化学与生物物理学报;1996年05期

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本文编号：338268