金黄色葡萄球菌XQ株生物学特性及毒力变异机制的研究

发布时间：2017-05-01 14:02

  本文关键词：金黄色葡萄球菌XQ株生物学特性及毒力变异机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),是一种重要的人畜共患病原菌,可引起多种疾病,危害人和动物健康。作为一种条件性致病菌,金葡菌的微生物病原特性非常复杂,其致病性与菌株毒力因子的表达密切相关。金葡菌的毒力因子包括一些能够破坏宿主细胞的外毒素以及与黏附和抵御宿主防御相关的分子,这些毒力因子的表达受多种调节因子的调控。1984年,在金葡菌中发现的Agr(Acessory gene regulator)二元调控系统,使人们对金葡菌的毒素调控有了新的认识。该系统由P2和P3两个操纵子组成,分别控制RNAII和RNAIII的转录。RNAII包含AgrA、AgrB、AgrC和AgrD4个开放阅读框,AgrD为信号分子前体,经AgrB加工处理后,形成有活性的自诱导肽(Autoinducing peptides,AIPs),分泌到胞外,AgrC为一种受体组氨酸蛋白激酶,可识别并结合同源的AIPs,使Agr C发生自磷酸化而被激活,进而磷酸化并激活效应分子Agr A,后者作为转录因子,可直接调控如酚溶解小肽PSM-α和-β等毒力因子表达,也可促进Agr系统P2和P3操纵子的转录;P3操纵子主要控制RNAIII的表达,除编码δ-溶素外,调节70多个基因的表达,包括30多个已知的金葡菌毒力基因。由于金葡菌存在多种多样的表型,各种表型之间的致病性也不尽相同。根据金葡菌七个看家基因的多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST),已发现2957种不同ST型别的金葡菌。不同国家和地区流行的金葡菌主要ST克隆型别不一,致病性差异也很大。其中,ST121型金葡菌就是一类致病性较强的菌株。2007年,德国Schefold等首次报道了ST121型金葡菌(spa分型为t284)导致一例51岁患者肺、肾等多器官功能衰竭的病例。Conceicao等的研究证实ST121型菌株在欧洲国家主要感染儿童,除皮肤、软组织侵害外,常伴有多种器官的侵袭性损害,致病能力强。我国目前尚未见对ST121型金葡菌致病性的研究报道。揭示特定型别金葡菌的生物学特征,毒力以及与之相关的毒力变异机制对于后续的研究具有十分重要的现实意义。本研究以临床分离的一株致病性较强的ST121型XQ株为研究对象,对其生物学特性及毒力变异的相关机制进行研究,主要研究内容和结果如下:1.病例报告及XQ株的分离鉴定xq株分离自我校某附属医院急诊科的一位17岁少年男性患者,因“全身风团伴发热,加重伴意识模糊3天”于2012年9月18日入住我校某附属医院急诊科,查体:一般情况差,浅昏迷状,体温38℃,脉搏150次/分,头、面部及全身皮肤可见多处脓疱和抓痕;血液检查示白细胞10.56×109/l,中性粒细胞92.6%;胸部正位x片示双肺斑片状高密度影,彩超示心包积液;从脓疱、血液和骨髓液中分离培养出革兰阳性球菌,应用美罗培南等抗生素控制感染无效,于9月21日晚10时死亡。分离的革兰阳性球菌经pcr扩增金葡菌特异基因femb、甲氧西林特异耐药基因meca以及金葡菌杀白细胞素pvl编码基因等进行初步鉴定。结果显示其为一株femb阳性、meca阴性、pvl阳性金黄色葡萄球菌,命名为xq株。同时我们对该案例进行了报道(revmedmicrobiol,2015)。2.xq株的分子分型通过一些常用的金葡菌分子分型方法对xq株进行分析,主要包括脉冲场凝胶电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,pfge)、多位点序列分析(multilocussequencetyping,mlst)、金黄色葡萄球菌表面蛋白a(staphylococalproteina,spa)可变区分型(spatyping)以及金葡菌附属基因调节系统(accessorygeneregulatorsystem,agr)分型等技术方法对其进行分析。pfge技术是一种分离大分子dna的方法,细菌染色体经酶切后的片段在特定的电泳系统中得到良好的分离。mlst分型方法基于核酸序列测定,以金黄色葡萄球菌的7个管家基因——arc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi、yqil为基础,pcr方法分别扩增不同大小的碱基片段,比较多态性位点的不同,从而得到不同的等位基因谱。葡萄球菌a蛋白(spa),作为一种金葡菌细胞壁的蛋白组成成分,其x区基因区呈多态性,并含有24bp的可变重复序列,重复序列两端为相对较保守的区域,这种基因多态性分型方法即为spa分型。金黄色葡萄球菌附属基因调节系统(agr)是金葡菌的一个重要的全局调节系统,根据agrd和agrc氨基酸序列和长度的多样性,可以将金葡菌的agr分为四种型别。xq株的分子分型结果显示xq株为一株st121型、spat159、agriv金葡菌。3.xq株的基本生物学特性研究采用血平板对xq株进行培养,观察其溶血活性,利用bhi培养基测定其生长曲线,采用balb/c小鼠分别经皮下及尾静脉接种,观察xq株的毒力。结果显示xq株的基本生物学特性(包括溶血性、生长曲线等)与对照菌atcc25923、rn4220以及n315有所不同,主要表现为溶血性增强,生长速率适中。用1×107cfu的xq株和标准株(atcc25923)分别经皮下感染小鼠,2周后,前者(xq株)创口出现宽而深的溃疡,后者(atcc25923)则趋于恢复;用1×105cfu的xq株和标准株atcc25923经尾静脉分别感染小鼠,2天内xq株感染组小鼠全部死亡,而atcc25923感染组小鼠7天仍安然无恙,表明xq株具有强致病性。4.xq株的体外连续传代及毒力变异为了检测xq株的毒力是否稳定,我们将其在体外lb连续传至200代。脉冲场电泳(pfge)显示xq株的基因组没有明显改变,但动物实验表明第180代菌株的致病力显著下降。推测在体外传代过程中,xq株表达的毒力因子发生了改变。对xq和xq180的培养上清进行sds-page分析,发现xq株的上清中有多条高表达的蛋白质主带,这些高表达的因子可能与xq株的强致病性密切相关。将每隔20代菌株的培养上清进行sds-page电泳分析,结果显示xq株在体外传20代后的细菌培养上清的分泌蛋白含量明显减少,表明xq株发生了变异,进一步分析发现在第五代的菌株,其培养上清的分泌蛋白谱即发生了改变。第5代细菌接种于tsb平板,结果出现了两种可稳定遗传的菌落,一种为金黄色,正常大小,另一种为浅黄色,菌落较大。动物实验表明,金黄色细菌毒力和xq野生株相似,而浅黄色菌落的毒力明显减弱,我们将毒力下降的浅黄色菌株命名为xqm株。5.xq株毒力变异的机制研究xq株与xqm株培养上清的蛋白表达谱有明显差异,这可能与xqm株的毒力下降有关,将xq株高表达的蛋白条带进行质谱分析,结果显示xq株上清蛋白差异的几条主要条带为三酰基甘油酯酶(triacylglycerollipase,76.6kda),pvl(panton-valentineleukocidin,37kda),α-溶血素(alpha-hemolysin,37kda),肠毒素b(superantigenenterotoxinseb,31kda),γ-溶血素(gamma-hemolysin,36kda),葡萄球菌的半胱氨酸蛋白酶(staphylococcalserineproteinasea,sspa,44kda)等,而金葡菌的这些毒力因子的表达主要受agr系统调控。xqm株中这些毒力因子表达的下降是否与其agr系统发生了变异有关?为证实这一假设,我们分别扩增了xq株和xqm株的agra、agrb、agrc、agrd基因,并送测序。结果发现xqm株的agrc基因第443位插入一段188bp的序列,而该插入序列正好为agrc基因的第255~442之间的序列。进一步地采用qrt-pcr检测了rnaiii、α-溶血素、γ-溶血素、肠毒素b、脂酶等受agr调控的毒力基因的表达情况,结果发现这些毒力基因的表达显著下降,表明xqm株毒力的下降是由于其agr的突变所致。本研究发现的xqm株agrc基因被自身重复序列插入而引起的突变尚少见文献报道。在课题研究中,我们也试探性地对xq株进行重组质粒的转化,试图用基因替换的方法在野生xq株agrc基因中插入本研究发现的188bp序列,探讨插入序列对菌株毒力的影响,但未获成功,可能由于金葡菌临床菌株对DNA转化存在多种限制。至于插入序列致agrC基因突变的具体机制以及agrC基因突变对XQM株毒力的调控作用还有待进一步深入研究。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 生物学特性 毒力变异 SDS-PAGE 附属基因调节系统
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.11
【目录】：

• 缩略语表4-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 1.1 选题缘由15
• 1.2 研究背景15-16
• 1.3 研究意义16
• 1.4 研究方法及内容16-18
• 第二章 XQ株的生物学特性研究18-43
• 2.1 材料与方法19-34
• 2.2 结果34-41
• 2.3 讨论41-43
• 第三章 XQ株的毒力变异及机制探究43-69
• 3.1 材料与方法43-57
• 3.2 结果57-66
• 3.3 讨论66-69
• 全文结论69-70
• 参考文献70-76
• 文献综述 Staphylococcus aureus ST121: A globally disseminated hypervirulent clone76-98
• References90-98
• 攻读学位期间的研究成果及参与的课题98-99
• 致谢99

【共引文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前8条

1 白同日格;牛粪堆肥中添加石灰氮对金黄色葡萄球菌的杀灭效果及堆肥发酵影响的研究[D];内蒙古农业大学;2011年

2 张璐;金黄色葡萄球菌毒力基因的分布和致病性的研究[D];河北农业大学;2012年

3 凌巍;金黄色葡萄球菌的分布及其肠毒素基因的研究[D];河北农业大学;2007年

4 索玉娟;食品中金黄色葡萄球菌的分布及其肠毒素基因的研究[D];河北农业大学;2008年

5 魏志恒;金黄色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究[D];河北农业大学;2009年

6 杨军;鸭源葡萄球菌分离鉴定、毒力基因检测及与致病性相关性研究[D];华中农业大学;2014年

7 徐继达;食源性金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因分布研究[D];河北农业大学;2013年

8 王佳;金黄色葡萄球菌毒素基因分布及转录水平表达研究[D];河北农业大学;2014年

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本文编号：339032