蛋白激酶SRPK2在小鼠睾丸组织的表达特征及初步功能研究

发布时间：2017-05-02 08:01

  本文关键词：蛋白激酶SRPK2在小鼠睾丸组织的表达特征及初步功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:明确丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,srpk2)m RNA及编码蛋白产物在小鼠睾丸组织不同细胞中的差异表达特征;进一步运用分子克隆技术构建srpk2的真核表达质粒并建立srpk2过表达HEK293T细胞模型;分析srpk2过表达对HEK293T细胞增殖和细胞周期的影响,及其与微管结构的相互关系,为深入探讨该基因在精子发生中的作用及意义奠定基础。方法:1.利用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)分析小鼠睾丸组织四种细胞系中srpk2基因m RNA的差异表达;2.利用蛋白免疫印迹技术(Western blotting)分析小鼠睾丸组织四种细胞系中srpk2基因编码蛋白产物的表达;3.应用免疫组化和免疫荧光技术检测SRPK2蛋白在小鼠睾丸组织的细胞定位;4.通过免疫荧光双重染色观察SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在生精细胞中的定位分布;5.利用分子克隆技术构建srpk2真核表达重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2;6.采用RT-PCR和Western blotting检测重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2转染HEK293T细胞后srpk2 m RNA和蛋白的表达水平;7.通过CCK-8和流式细胞术分别检测过表达srpk2后HEK293T细胞增殖能力和细胞周期变化;8.采用间接免疫荧光双重染色检测SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在HEK293T细胞中的定位分布;9.采用Western blotting检测srpk2过表达对聚合态和未聚合态微管蛋白影响。结果:1.实时定量PCR和Western blotting检测结果显示srpk2在小鼠精母细胞(GC2-spd)、小鼠支持细胞Sertoli(TM4)、小鼠间质细胞Leydig(TM3)中的表达水平相近,而在小鼠精原细胞(GC1-spg)中的表达水平较低;2.免疫组化结果表明SRPK2蛋白在曲精小管中的所有细胞均有分布,但在精子发生后期的长形精子细胞阶段相对集中,同时间质细胞也可见到阳性信号;3.免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位在精原细胞的胞浆,精母细胞和圆形精子细胞的胞浆和胞核都有分布,发育后期主要集中在长形精子细胞核附近,在间质细胞定位于胞浆;4.免疫荧光双重染色结果显示SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白在长形精子细胞核附近存在明显的共定位关系;5.DNA测序结果表明重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2构建成功;6.重组质粒转染HEK293T细胞后,经RT-PCR和Western blotting检测表明srpk2基因在HEK293T内实现了过表达;7.CCK-8检测结果显示过表达srpk2组HEK293T细胞的增殖率明显高于空载体组及裸细胞组(P0.05),流式细胞术检测发现过表达组HEK293T细胞的G1期明显降低(P0.05),差异均有统计学意义;8.细胞免疫荧光双重染色分析显示在HEK293T细胞内过表达的SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白存在共定位关系;9.Western blotting结果表明srpk2过表达可增加聚合态微管蛋白含量,而减少未聚合态微管蛋白含量。结论:1.srpk2在小鼠睾丸组织精原细胞、精母细胞、间质细胞Leydig、支持细胞Sertoli中均有表达,并且SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白存在明显的共定位关系;2.成功构建了srpk2的真核表达质粒,转染HEK293T细胞后,能够促进细胞增殖能力,缩短细胞周期G1期,过表达SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白存在共定位关系并对微管聚合具有促进作用。
【关键词】：SRPK2 精子发生 微管 HEK293T细胞 细胞转染
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R321.1;Q78
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用缩写词中英文对照表12-13
• 前言13-15
• 第一部分SRPK2在小鼠睾丸组织四种细胞系的表达定位15-35
• 1 材料与方法15-27
• 1.1 实验材料15-19
• 1.2 实验方法19-27
• 2 结果27-33
• 2.1 实时定量PCR检测srpk2基因mRNA在四种细胞系的表达27-28
• 2.2 Western blotting检测SRPK2蛋白在四种细胞系的表达28-29
• 2.3 免疫组织化学染色检测SRPK2蛋白在小鼠睾丸组织中的定位29-30
• 2.4 免疫荧光染色检测SRPK2蛋白在小鼠睾丸组织中的定位30-31
• 2.5 免疫荧光双重染色检测SRPK2和α-Tubulin在生精细胞中的定位31-33
• 3 讨论33-34
• 4 结论34-35
• 第二部分srpk2真核表达质粒的构建及其对微管的作用35-59
• 1 材料与方法35-47
• 1.1 实验材料35-37
• 1.2 实验方法37-47
• 2 结果47-57
• 2.1 RT-PCR扩增srpk2基因47
• 2.2 pMD?19-T-srpk2质粒的构建与鉴定47-48
• 2.3 真核表达重组质粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2的构建与鉴定48-50
• 2.4 重组质粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2在HEK293T细胞中的表达50-52
• 2.5 过表达srpk2基因对HEK293T细胞的影响52-57
• 3 讨论57-58
• 4 结论58-59
• 参考文献59-63
• 综述63-77
• 参考文献71-77
• 致谢77-78
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果78-79
• 个人简历79

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本文编号：340542